王紅梅，朱 艷，陳玉梁

(1.甘肅省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所,甘肅 蘭州 730070；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

牛皮蠅蛆病是由牛皮蠅、紋皮蠅和中華皮蠅的幼蟲寄生于牛或牦牛背部皮下組織所引起的疾病的統(tǒng)稱[1]，其危害牛的健康和皮革品質(zhì)，是草原放牧牛最常見和危害最嚴(yán)重的寄生蟲病之一，每年給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，皮蠅幼蟲還可寄生于人體，因而該病是一種人畜共患病[2-3]。

皮蠅的Hypodermin A (HA)是皮蠅幼蟲感染牛后能首先檢測(cè)到的重要抗原之一，也是牛皮蠅蛆病免疫診斷和基因工程疫苗研究的選擇性抗原[4]。純化的HA蛋白免疫牛后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，有效地抵抗病原的侵襲，為寄生蟲病疫苗的研制提供了依據(jù)[5]。由于提供足夠量的天然HA具有相當(dāng)大的難度，基因重組技術(shù)為免疫抗原的需求提供了平臺(tái)。有研究者采用大腸桿菌、果蠅、桿狀病毒和畢赤酵母等4種表達(dá)系統(tǒng)對(duì)HA蛋白進(jìn)行了體外表達(dá)研究[6]，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于不具有蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊與修飾作用，所表達(dá)的HA蛋白不具有酶活性；HA在果蠅表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)，產(chǎn)量可達(dá)到25 mg/L，但其無血清培養(yǎng)液過于昂貴，難以推廣應(yīng)用；采用桿狀病毒表達(dá)HA蛋白，所獲產(chǎn)量過低，無法滿足生產(chǎn)的需求；畢赤酵母蛋白表達(dá)產(chǎn)量高，是兼有真核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后修飾功能及原核表達(dá)系統(tǒng)方便、簡(jiǎn)單和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)的表達(dá)系統(tǒng)，為免疫抗原蛋白的生產(chǎn)提供了新的途徑。

紫花苜蓿(Medicagosativa)富含蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì)，是多種家畜喜食的優(yōu)質(zhì)飼草，素有“牧草之王”的美稱，是一種生產(chǎn)植物蛋白的巨大資源寶庫(kù)[7]，在實(shí)驗(yàn)室中又是牧草研究的模式植物。目前，已有多種病毒相關(guān)基因被導(dǎo)入苜蓿中，苜蓿表達(dá)的異源蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性，并能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較好的保護(hù)力[8-10]。本研究以紫花苜蓿優(yōu)良品種甘農(nóng)1號(hào)為受體材料，采用生物技術(shù)手段將HA抗原基因?qū)肫渲?，旨在為利用苜蓿作為生物反?yīng)器來生產(chǎn)可食性疫苗建立研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究材料 HA抗原材料由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所殷宏研究員提供；紫花苜蓿甘農(nóng)1號(hào)(M.sativacv.Gannong No.1)是適宜在牧區(qū)種植的抗旱、抗寒優(yōu)良品種，種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院曹致中教授提供。

1.2農(nóng)桿菌和質(zhì)粒 農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404，質(zhì)粒為pCAMBIA1300(由甘肅省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)。該質(zhì)粒攜帶組成型啟動(dòng)子CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HA基因，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移合成酶nptⅡ基因作為篩選標(biāo)記基因。

1.3苜蓿再生體系建立 選取飽滿的苜蓿種子，流水沖洗30 min，75%酒精消毒45 s，0.1%升汞消毒10 min，無菌水漂洗4次，吸干后接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)3 d，種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。取5～7 d苗齡的子葉和下胚軸，子葉沿葉脈方向切成兩半，下胚軸切成0.5 cm左右的小段，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，20 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基。每處理接種外植體30個(gè)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件為(25±1) ℃，光強(qiáng)度為2 500 lx，光照時(shí)間16 h/d。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2,4-D 1.0～2.0+6-BA 0～1.0；分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5+NAA 0.01～0.05+GA32.0；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA 0.5(激素單位：mg/L，pH值為5.8)。

1.4苜蓿轉(zhuǎn)化體系建立

1.4.1菌液濃度、浸染時(shí)間的確定 分別采用不同濃度的農(nóng)桿菌菌液浸染子葉，OD600分別為0.2、0.5、0.8、1.0，20 d后觀察愈傷組織并記錄結(jié)果。用OD600為0.5的農(nóng)桿菌菌液分別侵染子葉5、10和15 min，觀察愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)并記錄結(jié)果。

1.4.2共培養(yǎng)時(shí)間的選擇 農(nóng)桿菌浸染之后，設(shè)置共培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3、4和5 d，以研究共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響，不同處理在20 d后觀察愈傷形成情況。

1.4.3抑菌素質(zhì)量濃度的確定 分別采用質(zhì)量濃度為0、100、200、300、400和500 mg/L的頭孢霉素(Cef) 和羧芐青霉素(Carb)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行抗生素抑菌質(zhì)量濃度的選擇，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況。

1.4.4農(nóng)桿菌浸染和植株再生 將浸染過的子葉放在無菌的濾紙上，吸去表面多余的菌液，共培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)入加有50 mg/L Kan和500 mg/L Carb的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，約3 周后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植株再生，期間不斷調(diào)整抗菌素種類和質(zhì)量濃度。

1.5轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

1.5.1PCR檢測(cè) DNA提取采用CTAB微量法。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包含10 mmol/L Tris-HCl(pH值8.3)，1.8 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L dNTP，0.25 μmol/L引物，1 U Taq酶，約30 ng基因組DNA。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 50 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果用凝膠成像掃描儀拍照并保存。試驗(yàn)中所用生化試劑均為分析純，DNA Taq酶和電泳試劑購(gòu)自上海生工，引物[9]由大連寶生物技術(shù)有限公司合成，分別在上游引物和下游引物中引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物：5′-ACGAATTCATTGTTGGTGGCTTTGAGGCCGAT-3′，下游引物：5′-GCCTCGAGTTAAAAAGATTTTGCATTTTCAGTAATC-3′，劃線部分為內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。

1.5.2Southern分子雜交檢測(cè) 苜蓿總DNA提取、濃度純度測(cè)定、酶切、電泳、轉(zhuǎn)移印跡、固定等，參照王關(guān)林和方宏筠[11]提供的方法。探針制備、免疫檢測(cè)參見DIG DNA Labeling and Detection Kit使用說明。預(yù)雜交、雜交方法參見ULTR-AhybTM使用說明。

2 結(jié)果與分析

2.1外源激素對(duì)苜蓿外植體愈傷組織誘導(dǎo)和再生的影響 建立受體材料高效再生體系對(duì)于實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。針對(duì)甘農(nóng)1號(hào)苜蓿特定基因型篩選誘導(dǎo)再生的激素種類和濃度是實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的前提和保障。

2.1.1激素對(duì)紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響 采用MS基本培養(yǎng)基附加2,4-D和6-BA兩種不同質(zhì)量濃度的激素及其組合來誘導(dǎo)苜蓿子葉和下胚軸愈傷組織。培養(yǎng)期間發(fā)現(xiàn)2,4-D的存在及其質(zhì)量濃度直接決定了愈傷的發(fā)生和生長(zhǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)基中單純使用2,4-D誘導(dǎo)愈傷形成的作用較為明顯，子葉和下胚軸誘導(dǎo)率均為100%，且愈傷的增殖非?？?，但組織結(jié)構(gòu)過于疏松，表面呈白色粉末狀，完全沒有分化的可能；生長(zhǎng)素2,4-D與細(xì)胞分裂素6-BA的組合使用誘導(dǎo)效果較好(圖1A)，愈傷呈淺黃綠色顆粒狀，培養(yǎng)基MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高，子葉可達(dá)82%，有利于分化成苗。

2.1.2激素對(duì)苜蓿愈傷組織分化的影響 MS培養(yǎng)基附加不同種類和質(zhì)量濃度的外源激素，誘導(dǎo)外植體出芽時(shí)間和芽分化率存在顯著差異，子葉明顯優(yōu)于下胚軸。多次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在附加6-BA 0.5 mg/L和NAA 0.03 mg/L的培養(yǎng)基中，子葉愈傷組織15 d轉(zhuǎn)接一次，約40 d左右分化出芽(圖1B、1C)；在培養(yǎng)基中加入2 mg/L GA3能有效提高分化率，可達(dá)48.3%，GA3具有促進(jìn)幼芽發(fā)育成植株的作用。下胚軸愈傷組織需要在分化培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)接4～5次，才有少量愈傷分化出芽，分化率約3.7%，顯著低于子葉，嚴(yán)重制約著遺傳轉(zhuǎn)化效率。可見，選擇恰當(dāng)?shù)耐庵搀w類型對(duì)提高分化率非常關(guān)鍵。

圖1 甘農(nóng)1號(hào)苜蓿子葉愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生

2.2苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

2.2.1菌液濃度及感染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 通常情況下當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即OD600為0.5～0.6被認(rèn)為活力最好，感染力強(qiáng)，收集此時(shí)的菌體，用1/2 MS液體培養(yǎng)基稀釋，使其濃度(OD600)為0.2～1.0進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著菌液濃度的增大，苜蓿子葉愈傷誘導(dǎo)率逐步降低，但抗性愈傷組織誘導(dǎo)率在OD600為0.5時(shí)最高，大于0.5時(shí)逐漸降低。原因是隨著菌液濃度的不斷升高，細(xì)菌對(duì)外植體傷害越大，導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)率下降。用OD600為0.5的菌液分別浸染子葉5、10和15 min，觀察愈傷長(zhǎng)勢(shì)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，子葉浸染小于10 min時(shí)愈傷長(zhǎng)勢(shì)良好(圖2A、2B)，且抗性愈傷組織誘導(dǎo)率較高，10 min以上農(nóng)桿菌則會(huì)因過度生長(zhǎng)而無法抑制。因此，本研究中確定菌液適宜的浸染濃度(OD600)為0.5，浸染時(shí)間為8～10 min。

圖2 甘農(nóng)1號(hào)苜?？剐杂鷤M織誘導(dǎo)及植株再生

2.2.2共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響 外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)是T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的過程。農(nóng)桿菌浸染外植體后不能立即實(shí)現(xiàn)外源基因向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，一般認(rèn)為需經(jīng)過一定時(shí)間的“細(xì)胞調(diào)節(jié)期”才能發(fā)生這一過程[11]。因此，共培養(yǎng)時(shí)間的確定對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率有著重要的影響。本研究結(jié)果表明，苜蓿子葉共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，抗性愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)58.4%(圖3)，但子葉切口邊緣都有菌絲長(zhǎng)出，使后期培養(yǎng)過程中抑菌困難，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。由此，確定2 d為比較適宜的共培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.3選擇培養(yǎng)基中抑菌抗生素質(zhì)量濃度的選擇 當(dāng)頭孢霉素(Cef)和羧芐青霉素(Carb)質(zhì)量濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，但通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cef對(duì)苜蓿子葉的誘導(dǎo)分化起抑制作用，但不影響植株的生根。所以，在本研究中苜蓿外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，為了減少農(nóng)桿菌的污染，在外植體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上采取了先加500 mg/L Carb，然后在每次繼代時(shí)逐漸降低其質(zhì)量濃度，最低時(shí)用100 mg/L的Carb來抑菌。獲得Kan抗性植株后，生根階段采用200 mg/L Cef就可以有效抑制農(nóng)桿菌(圖2C)。

圖3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)子葉愈傷誘導(dǎo)率的影響

2.3轉(zhuǎn)基因苜蓿分子生物學(xué)檢測(cè)

2.3.1轉(zhuǎn)基因苜蓿PCR檢測(cè) 以質(zhì)粒pCAMBIA1300-HA的DNA為陽性對(duì)照，分別以非轉(zhuǎn)基因植株和無模板擴(kuò)增為陰性對(duì)照，用HA基因特異性引物對(duì)Kan抗性植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從獲得的56株轉(zhuǎn)化苗中，有7株擴(kuò)增出了大約697 bp的特異片段，陽性檢出率12.5%。檢測(cè)結(jié)果初步表明，HA基因已整合到受體苜?；蚪M中(圖4)。

圖4 部分轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

2.3.2轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR-Southern檢測(cè) 將PCR陽性植株和非轉(zhuǎn)基因植株的DNA經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與以地高辛標(biāo)記的HA基因特異PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交。結(jié)果顯示(圖5)，陰性對(duì)照無雜交條帶，陽性對(duì)照和轉(zhuǎn)化植株有明顯的雜交條帶，South-ern分子雜交結(jié)果進(jìn)一步證明了HA抗原基因已整合到了紫花苜?；蚪M中。

圖5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR-Southern檢測(cè)

3 討論

苜蓿作為轉(zhuǎn)基因受體材料，其本身存在著體細(xì)胞胚誘導(dǎo)困難、分化率低、重復(fù)性差等問題，這就嚴(yán)格制約著轉(zhuǎn)化效率的提高[12-13]。為此，有必要針對(duì)特定基因型材料建立高頻再生體系對(duì)實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。本研究中甘農(nóng)1號(hào)紫花苜蓿7 d苗齡的子葉再生頻率顯著高于下胚軸，生長(zhǎng)素2,4-D對(duì)誘導(dǎo)愈傷形成的作用明顯，6-BA和NAA的配合使用可提高子葉再生頻率，GA3可降低畸形苗的形成，促進(jìn)植株正常生長(zhǎng)發(fā)育。另外，影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素很多，并且各因素之間存在交互作用。本研究?jī)?yōu)化了紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化條件，確定菌液浸染濃度(OD600)為0.5，浸染時(shí)間為8～10 min，適宜的共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，子葉誘導(dǎo)分化階段使用Carb抑菌，再生植株壯苗期間使用Cef有利于生根，最終獲得了經(jīng)過分子鑒定的轉(zhuǎn)基因苜蓿植株。但與一些相關(guān)研究[14]相比，本研究中的轉(zhuǎn)化效率較低，原因是苜蓿外植體再生頻率存在基因型差異，甘農(nóng)1號(hào)紫花苜蓿再生頻率低，嚴(yán)重制約著遺傳轉(zhuǎn)化效率。因此，需要從建立高頻再生體系方面加強(qiáng)研究。

轉(zhuǎn)基因苜蓿作為植物生物反應(yīng)器具有操作方便、便于大面積推廣等許多潛在的優(yōu)勢(shì)，多數(shù)可直接飼用或食用。例如口蹄疫疫苗等可以免去提取、純化、注射等一系列過程，直接作為“口服疫苗”使用，為人類提供了一個(gè)更加安全和廉價(jià)的生產(chǎn)體系，展現(xiàn)出了非常廣闊的應(yīng)用前景[15]。但是在轉(zhuǎn)基因苜蓿疫苗的研究中，抗原表達(dá)量低及遺傳穩(wěn)定性差是限制其規(guī)?；l(fā)展的主要問題。一般考慮選用合適的強(qiáng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和改造表達(dá)載體等方法，來提高外源基因在苜蓿體內(nèi)的表達(dá)量[16]。本研究中獲得的轉(zhuǎn)基因苜蓿為皮蠅蛆病植物源疫苗的開發(fā)和應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)，但HA基因在苜蓿體內(nèi)是否表達(dá)及在后代材料中遺傳穩(wěn)定性如何還有待進(jìn)一步的研究。

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