岳冰冰，李 鑫，任芳菲，孟凡娟，孫廣玉

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

石油作為現(xiàn)代社會(huì)的主要能源，有“工業(yè)的血液”之稱(chēng)。目前世界石油年產(chǎn)總量已達(dá)2.2×1012kg，但是同時(shí)每年約有8×109kg石油污染物進(jìn)入環(huán)境，在我國(guó)，每年的新增污染土壤也有近1.0×108kg[1]。石油污染使土壤的土粒分散、通透性降低、結(jié)構(gòu)破壞，特別是其中的多環(huán)芳烴，有致癌、致變、致畸等活性以及能通過(guò)食物鏈在動(dòng)植物體內(nèi)逐級(jí)富集，危害著人類(lèi)健康。為了改善石油污染的環(huán)境，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者采用各種技術(shù)對(duì)污染土壤進(jìn)行修復(fù)，并取得了顯著性成果[2]。其中以生物修復(fù)技術(shù)具有處理費(fèi)用低、無(wú)二次污染、對(duì)環(huán)境影響小、可就地處理、公眾接受程度高和處理效果好等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具發(fā)展前景的方法[3]。植物修復(fù)技術(shù)是生物修復(fù)技術(shù)中的一種，以其具有吸收污染物能力強(qiáng)并兼顧美化環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)已成為人們普遍接受的去除石油污染物的首選技術(shù)。目前，人們已經(jīng)從植物體內(nèi)吸收、體內(nèi)降解、根際降解和植物刺激等[4]方面著手研究植物修復(fù)技術(shù)的機(jī)理，并取得了較大進(jìn)展。

紫花苜蓿(Medicagosativa)根系發(fā)達(dá)，主根粗長(zhǎng)，入土深3～6 m，與土壤接觸面積大[5-7]，并能通過(guò)根際作用降解更多的表層石油烴污染物[8]。因此，本研究選取在石油污染修復(fù)中具有巨大潛力的紫花苜蓿為研究對(duì)象，通過(guò)盆栽試驗(yàn)，對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油污染處理下紫花苜蓿的株高、葉片數(shù)、地上和根系干物質(zhì)量等一些基本生理指標(biāo)及其葉片中可溶性蛋白、淀粉、丙二醛、葉綠素含量等主要生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，初步探索紫花苜蓿對(duì)石油污染的耐受性，從而進(jìn)一步為石油污染土壤的生物修復(fù)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)條件 試驗(yàn)在東北林業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進(jìn)行，地處125°42′～130°10′ E，44°04′～46°40′ N。溫室晝夜溫度變化為23～25 ℃，光照強(qiáng)度為400 μmol/(m2·s)，光照周期12 h/12 h(光/暗)，相對(duì)濕度75%左右。

1.2試驗(yàn)材料 供試紫花苜蓿為自育品種“越冬之星”(黑龍江省審定品種)，受試污染物為采自大慶油田的原油。培養(yǎng)容器為26 cm×18 cm×8 cm(長(zhǎng)×寬×高)的長(zhǎng)方形平底塑料盤(pán)。發(fā)芽基質(zhì)取自東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)地表10 cm的清潔土，于室內(nèi)風(fēng)干、破碎、過(guò)1 mm篩。土壤有機(jī)質(zhì)含量為19.4 g/kg，pH值為6.8，土壤速效氮為164.5 mg/kg，速效磷為96.4 mg/kg，速效鉀為600.4 mg/kg。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)采用混油法，設(shè)4個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度： 0 mg/kg (CL0)，2 500 mg/kg (CL1)，5 000 mg/kg (CL2)，7 500 mg/kg(CL3)，每盆裝土1.5 kg，每處理3次重復(fù)。在土壤中均勻拌入一定比例的石油污染物(先將原油溶于石油醚中，然后與相應(yīng)土壤混勻，吸附平衡24 h后再均勻散開(kāi))。將紫花苜蓿種子在0.05%的高錳酸鉀溶液中浸泡消毒10 min，然后每塑料盤(pán)中均勻撒播100粒種子，播深0.5 cm左右。2008年2月初播種，3月間苗，分別于4月9日、4月23日和5月6日采摘完全展開(kāi)葉片，每個(gè)處理采摘10個(gè)葉片，采摘后立即在105 ℃烘箱中殺青10 min，65 ℃烘干至恒質(zhì)量，待粉碎研磨后進(jìn)行可溶性蛋白、淀粉、丙二醛及葉綠素含量的測(cè)定。于5月6日對(duì)紫花苜蓿的株高、葉片數(shù)、地上干物質(zhì)量和根系干物質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4測(cè)定項(xiàng)目及方法 可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[9]；淀粉含量測(cè)定采用蒽酮法[10]；丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[11]；葉綠素含量測(cè)定采用丙酮法[12]；株高用直尺測(cè)量；干物質(zhì)量用稱(chēng)量法測(cè)定。

1.5數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1石油污染對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響 隨著土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，紫花苜蓿株高、葉片數(shù)、地上干物質(zhì)和根系干物質(zhì)量都有不同程度地降低，當(dāng)石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 500 mg/kg時(shí)，分別比對(duì)照降低了71.1%、62.5%、48.1%和65.5%(表1)。分析表明，不同石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紫花苜蓿株高、葉片數(shù)、地上干物質(zhì)量和根系干物質(zhì)量的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。

表1 不同石油處理對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響

2.2紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量的變化 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油處理下紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量在4月9日和4月23日差異顯著(分別為FA=6.55>F0.05=4.07；FA=6.45>F0.05=4.07)(圖1)，而5月6日采摘的苜蓿葉片不同處理間差異不顯著(FA=1.39

不同石油污染處理對(duì)紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響如圖1所示。4月9日采摘的苜蓿葉片中，對(duì)照組(CL0)可溶性蛋白質(zhì)含量最高，且顯著高于CL1和CL2處理(P<0.05)，CL3含量次之，CL2含量最低。而4月23日和5月6日采摘的苜蓿葉片則是CL0可溶性蛋白質(zhì)含量最低，而混油處理的CL1、CL2和CL3的可溶性蛋白含量均顯著高于CL0。說(shuō)明在石油污染的脅迫下苜蓿葉片中可溶性蛋白含量增加，且隨石油濃度的增大而呈增加趨勢(shì)，但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7 500 mg/kg時(shí)，可溶性蛋白含量反而下降，這可能是石油污染濃度超過(guò)了植物體可適應(yīng)的臨界值，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量降低。

4月9日-5月6日，苜蓿葉片可溶性蛋白含量逐漸下降，其中CL0組下降最多，降低了20.37%，而混油處理的3組CL1、CL2和CL3分別下降了14.44%、13.55%和15.74%(圖1)。

圖1 紫花苜蓿葉片中可溶性蛋白含量

2.3紫花苜蓿葉片中淀粉含量的變化 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油處理下紫花苜蓿葉片中淀粉含量在4月9日和4月23日差異顯著(分別為FA=4.17>F0.05=4.07；FA=5.17>F0.05=4.07)，而5月6日采摘的苜蓿葉片不同處理間差異不顯著(FA=2.85

3次采樣的苜蓿葉片淀粉含量都隨石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，且CL2處理的淀粉含量達(dá)最高值(圖2)。分析4月9日-5月6日采樣的數(shù)據(jù)，CL0、CL1淀粉含量分別上升了13.65%和3.43%，而CL2、CL3分別下降了2.33%和19.73%，說(shuō)明隨著石油含量的升高，對(duì)植物生長(zhǎng)過(guò)程中淀粉含量積累的促進(jìn)作用有所降低。另外,4月23日淀粉含量明顯低于其他2次測(cè)定，具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖2 紫花苜蓿葉片中淀粉含量

2.4紫花苜蓿葉片中丙二醛含量的變化 不同石油污染處理下紫花苜蓿葉片中丙二醛含量在4月9日和5月6日差異不顯著(FA=3.37F0.05=4.07，P<0.05)，即不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油污染對(duì)丙二醛含量有顯著影響，表現(xiàn)出石油脅迫可以使丙二醛含量增加，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 500 mg/kg達(dá)到最高，其后隨著石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，但均顯著高于對(duì)照組(CL0)。5月6日采收葉片的丙二醛低于其他2個(gè)時(shí)期，這可能與紫花苜?？鼓嫘苑磻?yīng)閾值有關(guān)，此時(shí)期紫花苜蓿已經(jīng)渡過(guò)閾值期，對(duì)石油污染產(chǎn)生較強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受性。

圖3 紫花苜蓿葉片中丙二醛含量

在不同石油污染處理中，丙二醛的含量都隨采摘日期的推移而下降，分別降低了69.02%、60.67%、70.97%和68.49%，CL1的下降值明顯小于其他3種處理。

2.5紫花苜蓿葉片中葉綠素含量的變化 4月9日-5月6日隨著紫花苜蓿的生長(zhǎng)，對(duì)照組(CL0)的葉片中葉綠素的含量沒(méi)有明顯變化。4月23日和5月6日采集的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)石油處理間紫花苜蓿葉片中葉綠素含量差異顯著(FA=4.09>F0.05=3.01)。

3次采集樣品中的葉綠素含量都隨石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈上升的趨勢(shì)，對(duì)照組CL0的葉綠素含量最低；并且CL0的葉綠素含量4月9日-5月6日逐漸降低，而混油的3組處理的葉綠素含量都有不同程度地上升，CL1、CL2和CL3分別增加了9.12%、11.19%和26.37%，說(shuō)明隨著混油量的增加紫花苜蓿的葉綠素含量的上升量明顯加大。在5月6日的采集樣品中，CL3的葉綠素含量最大(圖4)。說(shuō)明紫花苜蓿在石油污染情況下，可通過(guò)增加葉綠素含量提高光合能力來(lái)適應(yīng)或補(bǔ)償逆境造成的損失，這也是植物對(duì)逆境的一種適應(yīng)性反應(yīng)。

圖4 紫花苜蓿葉片中葉綠素含量

3 討論與結(jié)論

石油主要成分為石油烴，大部分為高分子化合物，它們粘著在植物根系上形成一層粘膜，阻礙根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和根系的呼吸功能，甚至引起根系的腐爛，而石油中的烴組分可以直接進(jìn)入植物體內(nèi)對(duì)植物造成直接傷害[13]。另一方面石油類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入土壤, 會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，分散土粒, 使土壤的透水性降低，同時(shí)石油碳?xì)浠衔镂廴镜耐寥罆?huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的疏水性，導(dǎo)致不能正常吸濕和儲(chǔ)存水分，從而阻礙植物生長(zhǎng)[14]。本研究中石油污染土壤上種植的紫花苜蓿，其株高降低，葉片數(shù)減少，地上部干物質(zhì)量和根系干物質(zhì)量顯著下降，生長(zhǎng)受到明顯的阻礙，可能的原因之一是原油污染導(dǎo)致幼苗養(yǎng)分失衡和生理脫水[15]。

可溶性蛋白是植物代謝的調(diào)控和促進(jìn)物質(zhì)，其含量是植物合成和代謝能力的重要指標(biāo)。石油脅迫對(duì)紫花苜蓿中可溶性蛋白含量的影響，從總的變化趨勢(shì)看，經(jīng)石油處理后可溶性蛋白含量均高于對(duì)照組，隨著處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，這可能是在石油脅迫下，植物為了維持正常新陳代謝，產(chǎn)生了更多的蛋白質(zhì)，或使細(xì)胞內(nèi)的一些不可溶性蛋白轉(zhuǎn)化成了可溶性蛋白，這與李妮亞和高俊鳳[16]的研究結(jié)果相符。但當(dāng)處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)7 500 mg/kg時(shí)，苜蓿葉片中可溶性蛋白含量下降，這可能是由于超出了植物自身的耐受能力所致。

淀粉是植物體內(nèi)的貯藏養(yǎng)分。植物中淀粉含量的高低在一定程度上反映出環(huán)境對(duì)植物的影響。本研究對(duì)4月9日、4月23日和5月6日3次采摘的紫花苜蓿葉片中淀粉含量進(jìn)行了分析，結(jié)果是淀粉含量都隨著處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加有先升后降趨勢(shì)，這與曹文鐘等[17]的研究結(jié)果相類(lèi)似。這可能是低濃度的石油促進(jìn)了植物體內(nèi)淀粉的積累，使植物對(duì)逆境的耐性增強(qiáng)。但當(dāng)處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)5 000 mg/kg時(shí)，葉片中淀粉的含量開(kāi)始下降。隨著植物的生長(zhǎng)，CL0、CL1的淀粉分別上升了13.65%和3.43%，而CL2、CL3分別下降了2.33%和19.73%，這說(shuō)明隨著植物的生長(zhǎng)，石油污染土壤對(duì)植物淀粉含量積累的促進(jìn)作用有所降低。

丙二醛是植物在逆境和衰老條件下，膜脂發(fā)生過(guò)氧化作用的最終分解產(chǎn)物之一，其含量表示脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)損傷程度。本研究結(jié)果顯示，石油污染可以使植物葉片中丙二醛含量增加，當(dāng)處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 500 mg/kg時(shí)達(dá)到最高。這與馬麗等[18]的研究結(jié)果一致，即萘脅迫促使水稻(Oryzasativa)幼苗葉片中丙二醛含量隨萘濃度的增加而升高，處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80 mg/kg時(shí)，丙二醛高于對(duì)照組59.97%。丙二醛含量升高可能是由于石油脅迫使植物體內(nèi)的超氧化物自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)減少，活性氧增加，過(guò)多的氧自由基使細(xì)胞內(nèi)多種功能膜及酶系統(tǒng)遭到破壞，植物生理代謝紊亂，引發(fā)脂膜過(guò)氧化，從而丙二醛含量增加[19]。

葉綠素是植物進(jìn)行光和作用的主要色素，其含量的變化直接影響著植物的光合作用，是植物生長(zhǎng)的重要生理參數(shù)，可用于指示植物逆境條件下的受迫害程度。但是，植物在土壤逆境的條件下，可通過(guò)地上部分的代謝來(lái)適應(yīng)或補(bǔ)償土壤逆境帶來(lái)的生長(zhǎng)損失。本研究結(jié)果中不同程度的石油污染提高了葉片中葉綠素含量，即促進(jìn)了葉片中葉綠素的合成，通過(guò)光合能力來(lái)適應(yīng)石油污染逆境。

綜上所述，不同程度的石油污染對(duì)紫花苜蓿有很大影響，葉片中可溶性蛋白和淀粉含量隨著土壤中石油含量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而丙二醛和葉綠素含量明顯增加。從植物生理指標(biāo)來(lái)看，紫花苜蓿對(duì)石油具有一定的耐受能力，而且前人研究結(jié)果表明紫花苜蓿對(duì)土壤石油污染物具有一定得去除率[8]。生長(zhǎng)性狀受石油含量的影響極顯著，所以紫花苜蓿對(duì)石油污染土壤有很好的修復(fù)效果，不但能夠忍耐石油污染，而且能通過(guò)生物固氮作用為土壤提供有效的氮素來(lái)源，能很好地修復(fù)石油污染土壤。因此，紫花苜蓿是大慶油田具有很大潛力的石油污染修復(fù)植物。

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