馬學(xué)敏，張治安，鄧 波，張?zhí)N薇，高洪文，龐瑩瑩，楊世超，劉 蒙

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林 長春 130118; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草地研究所,北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

航天誘變育種又稱空間誘變育種，是指利用衛(wèi)星、飛船等返回式航天器或高空氣球?qū)⒅参锓N子、組織、器官或生命個(gè)體搭載到宇宙中，利用太空特殊的環(huán)境(空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素)使種子產(chǎn)生變化，引起生物體染色體畸變，進(jìn)而導(dǎo)致生物體遺傳變異，經(jīng)地面種植選育新種質(zhì)、新材料，培育新品種的植物育種新技術(shù)[1-2]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因其具有高蛋白、強(qiáng)固氮能力等優(yōu)點(diǎn)，被冠以“牧草之王”的美譽(yù)[3]。目前關(guān)于苜?？臻g誘變方面的研究主要集中在發(fā)芽率[4]、株高[5]、過氧化物同工酶[6]、細(xì)胞學(xué)效應(yīng)[7-9]等方面。但在抗氧化酶及相關(guān)物質(zhì)等生理方面的研究鮮見報(bào)道。以不同種子含水量紫花苜蓿衛(wèi)星搭載后與未搭載的種子生長的植株葉片為研究對象，通過對保護(hù)酶活性及丙二醛含量的測定，探討航天誘變對其抗氧化酶系及相關(guān)物質(zhì)的影響，以及種子水分含量對空間誘變結(jié)果的影響，為選育新的抗性品種提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 供試材料為紫花苜蓿“中苜一號(hào)”種子，經(jīng)衛(wèi)星搭載后第一代(SP1)第3年齡植株。材料由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草地研究所提供。

1.2方法

1.2.1種子水分預(yù)處理 參考韓建國[10]的研究方法，將原始含水量為9%的供試牧草種子分為5份,每份2.5 g。將待處理的種子裝入鋁箔袋中，按公式計(jì)算出使含水量達(dá)到9%、11%、13%、15%和17%時(shí)分別應(yīng)加的水量，含水量計(jì)算公式如下:

W2=W1×(100-A)/(100-B)

式中，A為種子初始含水量(%);B為所要達(dá)到的含水量(%);W1為稱取的種子質(zhì)量(g);W2為種子加水后質(zhì)量(g);所需加水量(mL)為W2-W1。

用微量注射器將所需的水量分別注入鋁箔袋中，封口后輕微晃動(dòng)使種子與水均勻混合，水平置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h。

1.2.2衛(wèi)星搭載處理 將經(jīng)過處理的種子分為兩份，一份種子封入布袋進(jìn)行搭載(SP)，“實(shí)踐八號(hào)”育種衛(wèi)星于2006年9月9日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心升空，衛(wèi)星在近地點(diǎn)187 km、遠(yuǎn)地點(diǎn)463 km的近地軌道運(yùn)行，于9月24日返回地面。另一份作地面對照(CK)，貯存于地面溫濕度相近(20℃左右)的環(huán)境中。2008年5月將兩份種子在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)芽，6月移栽到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站。于2010年4月底，以當(dāng)代(SP1)第3年齡植株為試驗(yàn)對象，在分枝期取植株中上部葉片作為試驗(yàn)材料，測定葉片超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶 (POD)活性及丙二醛(MDA)含量。

1.3測定方法 SOD、CAT、POD活性的測定：稱取葉片0.5 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入1 mL預(yù)冷的酶提取液(50 mmol/L的磷酸緩沖液，pH值7.8)，研磨成勻漿，加緩沖液使終體積為5 mL。在4℃條件下以12 000 r/min離心15 min。取上清液定容至5 mL，取其中1 mL稀釋至10 mL后用于CAT及POD的測定，未稀釋溶液用于SOD的測定。SOD活性采用NBT法[11]測定，以抑制NBT光化還原50%作為1個(gè)酶活單位(U)；CAT活性采用紫外吸收法[11]測定，以每分鐘內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位(U)；POD采用愈創(chuàng)木酚法[11]測定，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)。MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[11]測定。

1.4數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析，并用Excel做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1空間誘變對植株SOD活性的影響 地面對照組(CK)之間相比，隨著種子含水量的增加，植株葉片的SOD活性呈先下降后上升的變化，種子含水量為13%和15%的植株葉片SOD活性分別比9%的SOD活性降低78.33%和82.78%，差異顯著(P<0.05)(圖1)。衛(wèi)星搭載組(SP)之間相比，隨搭載種子含水量升高其植株葉片的SOD活性呈先升高后降低的變化，搭載種子含水量11%、13%和15%的植株葉片SOD活性比搭載9%的SOD活性分別提高33.16%、38.45%和36.32%，差異顯著(P<0.05)。衛(wèi)星搭載與地面對照組相比，種子含水量為11%、13%、15%和17%衛(wèi)星搭載植株葉片的SOD活性分別比相對應(yīng)種子含水量地面對照組的植株葉片的SOD活性提高61.49%、571.79%、735.48%和38.96%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為11%、13%和15%衛(wèi)星搭載植株葉片的SOD活性分別比種子含水量9%地面對照組的植株葉片SOD活性提高40.56%、45.56%和43.89%，差異顯著(P<0.05)。

圖1 不同含水量紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后植株葉片SOD活性的變化

2.2空間誘變對植株CAT活性的影響 地面對照組之間相比，隨著種子含水量的增加，植株葉片的CAT活性呈下降變化，種子含水量為15%和17%的植株葉片的CAT活性分別比9%的CAT活性降低61.78%和59.24%，差異顯著(P<0.05)(圖2)。衛(wèi)星搭載組之間相比，隨搭載種子含水量升高，其植株葉片CAT活性呈先升高后降低的變化，搭載種子含水量13%的植株葉片的CAT活性比搭載9%的CAT活性提高44.77%，差異顯著(P<0.05)。衛(wèi)星搭載與地面對照組相比，種子含水量為9%、11%、13%、15%和17%衛(wèi)星搭載植株葉片的CAT活性分別比相對應(yīng)種子含水量地面對照組的植株葉片的CAT活性提高30.36%、30.43%、104.19%、264.44%和140.63%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為13%和15%衛(wèi)星搭載植株葉片的CAT活性分別比種子含水量9%地面對照組的植株葉片的CAT活性提高85.99%和39.28%，差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同含水量紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后植株葉片CAT活性的變化

2.3空間誘變對植株P(guān)OD活性的影響 地面對照組之間相比，隨著種子含水量的增加，植株葉片的POD活性呈先下降后升高的變化，不同水分含量間雖有差異，但變化不明顯，只有13%含水量顯著低于15%和17%含水量的種子(P<0.05)(圖3)。衛(wèi)星搭載組之間相比，隨搭載種子含水量升高其植株葉片的POD活性呈先升高后降低又升高的變化；搭載種子含水量13%和17%植株葉片的POD活性比搭載9%的POD活性分別提高47.99%和52.10%，差異顯著(P<0.05)。衛(wèi)星搭載與地面對照組相比，種子含水量為9%、13%、15%和17%衛(wèi)星搭載植株葉片的POD活性分別比相對應(yīng)種子含水量地面對照植株葉片的POD活性提高45.29%、252.66%、54.85%和82.65%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為13%、15% 和17%衛(wèi)星搭載植株葉片的POD活性分別比種子含水量9%地面對照的植株葉片POD活性提高115.01%、76.72%和120.99%，差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同含水量紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后植株葉片POD活性的變化

2.4空間誘變對植株MDA含量的影響 地面對照組之間相比，隨著貯藏種子含水量的增加，植株葉片MDA含量呈先上升后下降的變化，種子含水量為13%植株葉片的MDA含量比9%的MDA含量升高15.35%，差異顯著(P<0.05)。衛(wèi)星搭載組之間相比，隨搭載種子含水量升高，其植株葉片的MDA含量呈先降低后升高的變化，搭載種子含水量13%和15%的植株葉片MDA的活性比搭載9%的MDA含量分別降低29.89%和13.45%，差異顯著(P<0.05)(圖4)。衛(wèi)星搭載與地面對照組相比，種子含水量為13%和15%衛(wèi)星搭載植株葉片的MDA活性分別比相對應(yīng)種子含水量地面對照組的植株葉片MDA含量降低40.54%和25.06%，差異顯著(P<0.05)。種子含水量為13%和15%衛(wèi)星搭載植株葉片的MDA含量比種子含水量9%地面對照組的植株葉片MDA含量降低31.42%和15.33%，差異顯著(P<0.05)。MDA的變化與保護(hù)酶的變化相一致。

圖4 不同含水量紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后植株葉片MDA含量的變化

3 討論與結(jié)論

本研究得出，地面對照組植株的保護(hù)酶活性及丙二醛含量在水分的影響下呈負(fù)效應(yīng)，降低了植物的抗氧化能力。在空間誘變條件下，搭載種子植株的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的酶活性增強(qiáng)，丙二醛含量降低，說明衛(wèi)星搭載后紫花苜蓿的抗氧化能力提高。這與Xue等[15]研究結(jié)果一致，其研究結(jié)果表明空間處理后月季(Rosachinensis)組培苗葉片中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的活性均有所增加，而丙二醛的含量下降。尚晨等[12]在利用高能混合粒子場的地面模擬試驗(yàn)中，也指出輻射增強(qiáng)了M2代的超氧化物歧化物酶的活性。

另外在本研究中，空間環(huán)境下不同含水量種子的植株所產(chǎn)生的誘變效應(yīng)并不一致，這可能與空間的復(fù)雜環(huán)境(微重力、零磁空間、宇宙射線)相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，超氧化物歧化酶在11%、13%和15%處理時(shí)誘變效應(yīng)增強(qiáng)；過氧化氫酶在13%的處理效應(yīng)最強(qiáng)；過氧化物酶則在13%和17%的處理下誘變效應(yīng)最大；丙二醛的誘變效應(yīng)在13%和15%下最強(qiáng)，且丙二醛含量的變化與保護(hù)酶活性的變化相一致。這說明植物種子較高水分含量可以促進(jìn)空間誘變效應(yīng)的強(qiáng)度，但種子水分過高時(shí)誘變效應(yīng)又會(huì)減弱。任衛(wèi)波等[13-14]在研究中得出空間環(huán)境處理后新麥草(Psathyrostachysjuncea)株高、生殖枝數(shù)、單株種子產(chǎn)量顯著增加，種子千粒重降低；種子含水量對空間環(huán)境誘變效果有顯著影響，當(dāng)種子水分接近10%時(shí)，誘變效應(yīng)減弱；當(dāng)種子水分>10%時(shí)，誘變效應(yīng)開始增強(qiáng)；空間環(huán)境對新麥草二代種子發(fā)芽能力、種苗生長、種子浸出液電導(dǎo)率有顯著影響，具體變化因品種而異；當(dāng)種子含水量為10%～12%，誘變效應(yīng)減弱，當(dāng)含水量偏離這一范圍時(shí)，誘變效應(yīng)增強(qiáng)。以上說明種子含水量對空間誘變效應(yīng)有一定的影響，可能是因?yàn)榉N子含水量改變了種子的生理狀態(tài)，使其處于休眠向萌動(dòng)過渡時(shí)期，增加了空間誘變敏感性[13,16]。但其機(jī)理目前尚不清確，還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，空間誘變對植株的抗逆性可產(chǎn)生正效應(yīng)的結(jié)果，并在含水量13%、15%時(shí)達(dá)到最大的誘變效應(yīng)，可作為新品種選育的研究手段，進(jìn)一步進(jìn)行研究。但這種變化是純生理的還是遺傳學(xué)物質(zhì)的改變引起的，還需要進(jìn)一步深入的研究。本研究的結(jié)果可以為進(jìn)一步深入的研究奠定基礎(chǔ)，以期為選育出新的、穩(wěn)定的品種提供參考。

[1] 密士軍,郝再彬.航天育種研究的新進(jìn)展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2002(4):31-33.

[2] 陳積山，張?jiān)聦W(xué)，唐鳳蘭.我國草類植物空間誘變育種研究[J].草業(yè)科學(xué),2009,26(9):173-177.

[3] Zietkiewicz E,RafalskiA,Labuda D.Genome fingerprinting by simple quence repeat (SSR)-anchored polymemse chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[4] 任衛(wèi)波,王蜜,陳立波,等.衛(wèi)星搭載對苜蓿種子PEG脅迫萌發(fā)及生長的影響[J].草地學(xué)報(bào),2008,16(4):428-430.

[5] Ren W B,Zhao O L,Wang M,etal.Preliminary study on the mutagenic effects of space flight on alfalfa seeds[J].Agricultural Science & Technology,2008,9(4):51-55.

[6] 徐云遠(yuǎn),王鳴剛,賈敬芬.衛(wèi)星搭載紅豆草后代中耐鹽細(xì)胞系的篩選及鑒定[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),2001,34(1):11-15.

[7] 任衛(wèi)波,徐柱,陳立波,等.紫花苜蓿種子衛(wèi)星搭載后其根尖細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2008,22(5):566-568.

[8] 杜連瑩,韓微波,張?jiān)聦W(xué),等.“實(shí)踐八號(hào)”搭載8個(gè)苜蓿品種細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究[J].草業(yè)科學(xué),2009,26(12):46-49.

[9] 馮鵬,李鍵,張?zhí)N薇,等.不同含水量紫花苜蓿種子空載后當(dāng)代葉片顯微和超微結(jié)構(gòu)研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2009,23(4):561-565.

[10] 韓建國.實(shí)用牧草種子學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1997:153-155.

[11] 張治安,張美善.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].吉林大學(xué)出版社,2006.

[12] 尚晨,韓貴清，陳積山，等.高能混合粒子場處理種子對龍牧803苜蓿M2代的抗寒性影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(6)：164-168.

[13] 任衛(wèi)波，韓建國，張?zhí)N薇，等.衛(wèi)星搭載對新麥草種子含水量的影響(簡報(bào))[J].草地學(xué)報(bào)，2006，14(3)：292-294.

[14] 任衛(wèi)波，韓建國，張?zhí)N薇，等.衛(wèi)星搭載對新麥草二代種子活力的影響[J].草原與草坪，2007(1):42-45.

[15] Xue H，Liu M，Lu J Y，etal．Effects of space environment on biological characters of tissue cultured rose seedlings[J]．Progress in Natural Science，2005，15(5)：414-418.

[16] 任衛(wèi)波,韓建國,張?zhí)N薇.幾種牧草種子空間誘變效應(yīng)研究[J].草業(yè)科學(xué),2006,23(3):72-76.