徐寒松 吳 青 謝曉云 孔德明 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 (貴陽(yáng) 550003)

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂綜合征。其慢性并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,是糖尿病患者致殘致死的主要原因。糖尿病慢性并發(fā)癥基礎(chǔ)的病理改變主要是微血管病變和大血管病變,EPCs參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程[1],因此,EPCs可作為組織工程中血管的種子細(xì)胞來源。但 EPCs在正常人骨髓及外周血循環(huán)中數(shù)量較少,研究結(jié)果顯示,從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出來的EPCs僅為 0.05%～ 0.1%[2]。其培養(yǎng)方法復(fù)雜,成本較高,給其研究帶來不便。本研究在 EPCs的培養(yǎng)中以自行制備的鼠尾膠原代替昂貴的纖維連接蛋白,并觀察其培養(yǎng)細(xì)胞的效果,期望以最低的花費(fèi)獲得能構(gòu)建組織工程血管的足夠的種子細(xì)胞。我們的前期研究證實(shí)黃芪能促進(jìn)正常及糖尿病條件下 EPCs的增殖和分化[3,4],黃芪多糖(APS)是黃芪的主要活性物質(zhì),具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、調(diào)節(jié)血糖及改善脂代謝和胰島素抵抗的作用[5～11],但其對(duì) EPCs的影響目前未見報(bào)道。本研究通過觀察APS對(duì) T2DM外周血 EPCs增殖的影響,探討黃芪多糖在糖尿病血管并發(fā)癥治療中的可能機(jī)制。

1 材 料

1.1 標(biāo)本 T2DM的診斷參照 1999年 W HO診斷標(biāo)準(zhǔn)。T2DM患者(T2DM組)及健康人組 (Con組)各 20例,均來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院,T2DM組為內(nèi)分泌科住院患者,入選患者無他汀類藥物降脂治療史。Con組為體檢中心經(jīng)體檢健康者。采集空腹外周血 30mL/例,均獲得獻(xiàn)血者知情同意。所有獻(xiàn)血者均排除炎癥、近期外傷、手術(shù)史、皮膚潰瘍、心血管、血液系統(tǒng)疾病等影響 EPCs的因素。Con組的血標(biāo)本不進(jìn)行任何干預(yù),僅做正常對(duì)照。

1.2 藥物與試劑 M 199培基 (Hyclone),胎牛血清(Gibco),VEGF、bFGF(PeproTech),人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊?,FITC-U EA-1、Dil-acLDL(Sigma),黃芪多糖粉針劑(天津賽諾制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:Z20040086,批號(hào):080901,每支 250mg),M T T、DM SO、胰蛋白酶 (Amresco),PE直標(biāo)鼠抗人 CD133、FITC直標(biāo)鼠抗人 CD34單克隆抗體、KDR單克隆抗體(R&D SYSTEMS),健康 SD大鼠購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 方法

2.1 鼠尾膠原的制備 水合氯醛腹腔注射麻醉 SD大鼠后,剪下鼠尾浸泡在 75%酒精中 30min后,在無菌雙蒸水中反復(fù)沖洗 2～ 3次,在超凈臺(tái)內(nèi)將鼠尾剪成小段,抽出尾腱置平皿中,盡可能剪碎,將剪碎的肌腱浸入 0.1%無菌醋酸中(每 1g尾腱加入 50mL的 0.1%無菌醋酸),置 4℃冰箱中振搖 48～ 72h,使肌腱充分溶解成為膠原溶液。再移入無菌離心管內(nèi) 4000r/min離心 30min,取上清液分裝入無菌小瓶,-20℃保存?zhèn)溆?。可以繼續(xù)向離心后的沉淀中加入適量醋酸,重復(fù)以上步驟,以制備更多的鼠尾膠原。

2.2 EPCs的分離、培養(yǎng) 密度梯度離心法獲取 T2DM患者與健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞,各用 5mLM199培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、VEGF12ng/mL、bFGF4ng/mL、青霉素 100U/mL、鏈霉素 100U/mL)重懸,加到鼠尾膠原預(yù)包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),4d后首次換液,以后隔日換液培養(yǎng)至 7d,收集貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。

2.3 EPCs的鑒定 細(xì)胞與 Dil-acLDL及 FITC-UEA-1孵育后,激光共聚焦顯微鏡鑒定 EPCs;流式細(xì)胞儀檢測(cè) EPCs表面抗原標(biāo)志,Cell Quest軟件定量分析每管樣品中 10000個(gè)細(xì)胞,分析 CD34、CD133和 KDR的陽(yáng)性表達(dá)百分率。

2.4 M T T實(shí)驗(yàn)觀察黃芪多糖對(duì) T2DM EPCs的影響以健康人 EPCs做為對(duì)照,用含不同濃度黃芪多糖組的 M199培養(yǎng)基 (黃芪多 糖終濃度分 別為 0、 50mg/l、 200mg/l、 800mg/l、3200mg/l、6400mg/l)干預(yù) T2DM患者 EPCs,分別培養(yǎng) 6、12、24、48h。取 490nm波長(zhǎng),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A值),記錄結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以(±s)表示 ,各組間均數(shù)比較采用 ANOV A分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié) 果

4.1 臨床資料比較 T2DM組和 Con組在性別、年齡、吸煙、血脂方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),HbA1c水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P ＜0.05)(表 1)。

表1 T2DM組和 Con組基本臨床資料比較(±s)

表1 T2DM組和 Con組基本臨床資料比較(±s)

與 con組比較 ,△ P＜0.05.

組別 n 年齡 男/女 FPG 2hPG HbA1C T C LDL DM病程 吸煙T2DM 20 60± 7 8/12 7.72± 0.72△ 11.5± 1.7△ 7.8± 0.68△ 4.45± 0.45 2.69± 0.29 10.4± 3.2 3 Con 20 59±8 9/11 4.85±0.36 6.65±0.65 4.77±0.40 4.41±0.38 2.56±0.52 — 4

4.2 EPCs的形態(tài)學(xué)觀察 T2DM組和 Con組外周血單個(gè)核細(xì)胞接種于鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞大多呈懸浮生長(zhǎng),第 2天可見少數(shù)細(xì)胞貼壁 ,第 4天左右可以形成從中間向外放射的細(xì)胞集落,其上常附著少量圓形細(xì)胞;以后梭形細(xì)胞逐漸增多,7d時(shí)長(zhǎng)成典型的長(zhǎng)梭形、雙極針狀(A),并出現(xiàn)有的細(xì)胞首尾相連成條索狀(B)。培養(yǎng)第 2周時(shí),梭形細(xì)胞開始消失,取而代之出現(xiàn)的是橢圓形細(xì)胞,呈鵝卵石樣(C),有的細(xì)胞可形成管腔狀結(jié)構(gòu)(D)。種植 1.0×106個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞約可獲得(5.5～ 6)× 104個(gè)貼壁細(xì)胞。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

4.3 EPCs的鑒定

單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng) 7d后通過激光共聚焦顯微鏡鑒定,細(xì)胞攝取 Dil-acLDL(紅色,激發(fā)波長(zhǎng) 543nm)和結(jié)合 FITC-U EA-1(綠色,激發(fā)波長(zhǎng) 477nm),Dil-acLDL和 FITC-UEA-1雙染色陽(yáng)性細(xì)胞(呈黃色)被認(rèn)為是正在分化的 EPCs,見圖 2。流式細(xì)胞儀檢測(cè)貼壁細(xì)胞表面標(biāo)志,結(jié)果顯示:貼壁細(xì)胞中,表達(dá)CD34占 (32.15± 8.68)%,表達(dá) CD133占 (18.73± 7.12)%,表達(dá) KDR占 (69.45± 8.21)%,見圖 3。

圖2 激光共聚焦顯微鏡鑒定培養(yǎng) 7d的 EPCs

圖3 EPCs表面抗原標(biāo)志檢測(cè)

4.4 M T T檢測(cè)黃芪多糖對(duì) T2DM外周血 EPCs增殖的影響 T2DM患者 EPCs的增殖能力較健康對(duì)照組明顯下降(P＜0.05)。黃芪多糖(APS)顯著增加 T2DM患者 EPCs的增殖能力,呈一定的量效與時(shí)效關(guān)系,在 200mg/L濃度時(shí)開始較T2DM對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.01),于 800mg/l時(shí)達(dá)最大效應(yīng)(P＜0.01),故在觀察 PI3K阻斷劑影響的試驗(yàn)中選擇 800mg/L的黃芪多糖培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞 24 h。200mg/LAPS作用 6h后,EPCs增殖能力開始明顯增強(qiáng),24h達(dá)到高峰,48h時(shí)略有下降,但仍明顯高于對(duì)照組。 (表 1)。

表1 黃芪多糖對(duì) T2DM患者 EPCs增殖作用的影響(±s)

表1 黃芪多糖對(duì) T2DM患者 EPCs增殖作用的影響(±s)

注:與 T2DM組比較 ,△P＜0.01;與健康對(duì)照組比較,▲P＜0.05。

A490nm值組別6h 12h 24h 48h Con組 0.332± 0.003 0.380± 0.004 0.479± 0.004 0.461± 0.003 T2DM對(duì)照組 0.306±0.015▲ 0.353±0.011▲ 0.455± 0.018▲ 0.433±0.001▲APS 50mg/L組 0.315± 0.010 0.362± 0.012 0.476± 0.006 0.437± 0.014 APS 200mg/L組 0.322± 0.008△ 0.374± 0.008△ 0.487± 0.018△ 0.469± 0.002△APS 800mg/L組 0.324± 0.001△ 0.396± 0.010△ 0.500± 0.010△ 0.488± 0.011△APS3200mg/L組 0.305± 0.007 0.346± 0.013 0.443± 0.009 0.429± 0.010 APS6400mg/L組 0.292± 0.016△ 0.335± 0.010△ 0.420± 0.015△ 0.395± 0.006△

5 討 論 EPCs是一類能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,存在于骨髓、脂肪組織、臍帶血和外周血中。EPCs不僅參與人胚胎血管生成,同時(shí)也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。糖尿病患者外周血 EPCs數(shù)量減少,其增殖、遷移和成血管能力降低,設(shè)法增加 EPC的數(shù)量并改善其功能可促進(jìn)損傷血管的修復(fù)和新生,為防治糖尿病血管并發(fā)癥提供了新的治療策略。

成人外周血 EPCs含量極少,從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離出來的 EPCs僅占 0.05%～ 0.1%,如何將 EPCs進(jìn)行體外擴(kuò)增是關(guān)鍵。內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)有別于其它成體干細(xì)胞,其培養(yǎng)基要求 EGM-2MV專用培養(yǎng)基,但是專用培養(yǎng)基價(jià)格昂貴,很多學(xué)者根據(jù) EGM-2MV的主要成分使用 M199培養(yǎng)基添加VEGF、bFGF、EGF和 IGF-1等細(xì)胞因子同時(shí)配合胎牛血清,來代替專用培養(yǎng)基,用于內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)。在培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞之前,培養(yǎng)板往往要包被纖維連接蛋白或者明膠幫助細(xì)胞貼壁,有利于細(xì)胞快速貼壁生長(zhǎng)。本研究只用了 V EGF、bFGF兩種細(xì)胞因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn) EPCs的分化和生長(zhǎng)狀態(tài)良好。初始貼壁生長(zhǎng)的 EPCs逐漸形成長(zhǎng)梭形,但增殖緩慢;在第 2周左右,開始出現(xiàn)鋪路石樣細(xì)胞,增殖較快。這與 Gulati等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。纖維連接蛋白是基質(zhì)中一種糖蛋白,主要起促進(jìn)細(xì)胞貼壁的作用,但價(jià)格昂貴。鼠尾膠原的主要成分為 I型膠原,具有成本低廉、取材方便和黏附力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可用于培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮膚角朊細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞等。宋曉紅等[13]以鼠尾膠原為黏貼劑建立了人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞培養(yǎng)模式。由于許多細(xì)胞在 I型膠原中培養(yǎng)可獲得與機(jī)體相似的組織形態(tài),如頜下腺上皮細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞可分別增殖分化形成腺管樣結(jié)構(gòu),因此鼠尾膠也常被用于管狀結(jié)構(gòu)新生模型的研究。李明煥等[14]發(fā)現(xiàn)在鼠尾膠中,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下,可以形成樹枝狀毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu);章必成等[15]以鼠尾膠原為貼黏劑成功培養(yǎng)了小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,并具有形成淋巴管樣結(jié)構(gòu)的能力。本研究使用了自行制備的鼠尾膠原,沒有使用昂貴的纖維連接蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)也能獲取較多的 EPCs,但其成本卻大大減低。

研究表明 GM-CSF、 G-CSF、V EGF、他汀類、雌激素、ACEI、EPO等動(dòng)員骨髓釋放 EPCs并使其功能正?；?。APS是黃芪的主要活性物質(zhì),能使人外周血單核細(xì)胞(PBM C)產(chǎn)生 GCSF和 GM-CSF等造血細(xì)胞因子,并呈量效時(shí)效關(guān)系[16];能有效地促進(jìn)小鼠和人骨髓與外周血造血干 /祖細(xì)胞的增殖。 EPCs和造血干細(xì)胞來源于共同的祖細(xì)胞,均由成血管細(xì)胞分化而來?；?EPCs和造血干細(xì)胞的密切關(guān)系,推測(cè) APS可能影響EPCs的數(shù)量及功能。本研究證實(shí)了 APS在一定范圍內(nèi)呈劑量和時(shí)間依賴性地促進(jìn) EPCs增殖?？梢?APS不僅具有保護(hù)胰島β細(xì)胞,調(diào)節(jié)血糖 ,改善脂代謝和胰島素抵抗的作用[5～11];可能還通過促進(jìn) EPCs的增殖、分化,促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù),在治療糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,本研究建立了一種培養(yǎng)擴(kuò)增人外周血中 EPCs的簡(jiǎn)便且低成本的方法,為 EPCs的進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。黃芪多糖可能通過促進(jìn) T2DM患者外周血 EPCs的增殖、分化 ,達(dá)到治療糖尿病血管并發(fā)癥的目的,但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究來闡明。

[1] Hill JM,Zalos G,Halcox JP,et al.Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk[J].N Engl JMed,2003(348):593-600.

[2] Reyes M,Dudek A,Jahagirdar B,et al.Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow[J].J Clin Invest,2002(109):337-346.

[3] 徐寒松,雷閩湘,孔德明,等.黃芪對(duì) 2型糖尿病外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、分化的影響 [J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)),2009,24(2):234-237.

[4] 徐寒松,雷閩湘,劉澤灝,等.黃芪對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響 [J].中醫(yī)雜志,2008,47(2):160-166.

[5] 周云楓 ,吳 勇,歐陽(yáng)靜萍.黃芪多糖對(duì) 2型糖尿病大鼠腎組織胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響 [J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,26(2):139-142.

[6] Werner N,Nickenig G.Clinical and therapeutical implications of EPC biology in atherosclerosis[J].J Cell Mol Med,2006,10(2):318-332.

[7] 李如江,邱曙東,陳紅霞,等.黃芪多糖對(duì) 1型糖尿病小鼠胰腺β細(xì)胞總質(zhì)量的影響 [J].中國(guó)中藥雜志,2007,32(20):2169-2173.

[8] 陳 蔚 ,李益明,俞茂華,等.黃芪多糖對(duì)糖尿病鼠 T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)作用 [J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(1):28-31.

[9] 胡琛琛,畢會(huì)民,張葉敏,等.黃芪多糖對(duì) 2型糖尿病大鼠肝臟 CHO P表達(dá)的影響 [J].微循環(huán)學(xué)雜志,2010,20(1):1-3,12.

[10] 陳 蔚,陳雯潔,夏燕萍,等.黃芪多糖對(duì)糖尿病倉(cāng)鼠脂代謝紊亂及心肌 PPAR-α表達(dá)的影響 [J].復(fù)旦學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版),2010,37(2):194-197,215.

[11] 徐 怡,王保華,李 柯,等.黃芪多糖的胰島素增敏作用及其對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酯酶 1B的影響[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,31(3):288-291,308.

[12] Gulati R, Jevremovic D,Peterson T E,et al.Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood[J].Circ Res,2003,93(11):1023-1025.

[13] 宋曉紅,張 羅,韓德民,等.鼠尾膠原為底物的人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞培養(yǎng)模式的建立[J].中國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科,2007,2(14):107-111.

[14] 李明煥,田 鏵,劉執(zhí)玉,等.ECV304細(xì)胞用于三維血管新生的研究 [J].中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2004,7(3):165-167.

[15] 章必成,王 俊,趙 勇,等.以鼠尾膠為貼黏劑的小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立 [J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(5):390-393.

[16] 婁小芬,張炳華,宋 京,等.黃芪多糖對(duì)有核細(xì)胞分泌造血因子的影響 [J].中藥新藥與臨床藥理,2003,14(5):310-312.