西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腦病科(西安 710004)

尤雪梅▲ 張巧俊△ 李立博 王 濤★ 惠艷娉 馮建軍

帕金森病(Parkinson disease,PD)不僅僅是一個運動系統(tǒng)的疾病,常同時并有抑郁、焦慮和認知功能障礙等非運動系統(tǒng)的癥狀[1]。內側前額葉皮層(Medial prefrontal cortex,mPFC)接受來自腹側被蓋區(qū)的多巴胺(Dopamine,DA)能神經(jīng)纖維支配,m PFC與情感行為、學習與記憶等諸多腦的高級功能密切相關。因此,mPFC的神經(jīng)活動以及受體功能的改變可能與 PD非運動系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn)和維持有關。然而,目前對于 PD狀態(tài)下 mPFC中神經(jīng)元的活動以及各種受體變化的了解并不多。有研究證實 mPFC中有高密度的 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受體表達,其中 50%～60%的錐體神經(jīng)元和 20%～ 30%的 GABA能神經(jīng)元上都有 5-HT1A受體表達,5-HT1A受體在神經(jīng)元的電活動及遞質釋放的調解中起重要作用[2～4]。為此,本實驗通過免疫組化方法觀察 5-HT1A受體在 PD模型大鼠 mPFC中的表達變化,以了解黑質-紋狀體通路損毀對 m PFC中 5-HT1A受體表達的影響;采用玻璃微電極細胞外記錄法,觀察 PD模型大鼠 mPFC神經(jīng)元電活動的變化。為進一步闡明 PD狀態(tài)下 5-HT系統(tǒng)在帕金森病非運動系統(tǒng)癥狀發(fā)生中的病理生理學機制提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物 選用健康雄性 SD大鼠(260～320g)24只,由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。大鼠在標準環(huán)境下飼養(yǎng),室溫 20～25℃,24h循環(huán)光照,自由攝食飲水,預養(yǎng) 1周后,隨機分為 2組,對照組 (n=8)和 PD組 (n=16)。

2 PD模型的制備 采用改進的微量注射器與空心玻璃微電極結合的 6-羥多巴胺(6-hydrodopamine,6-OHDA)兩點腦內微量注射法選擇性損毀右側黑質致密部(SNc)的 DA能神經(jīng)元。根據(jù) Paxions-Watson大鼠腦定位圖譜定位 SNc,坐標:前囟后 AP-4.8～ 5.3mm,矢狀縫右旁開 1.8～ 2.3mm,顱骨膜下 D7.1～7.3mm。術后 1周行阿樸嗎啡(Apornorphine,APO)皮下注射檢測旋轉行為,若大鼠在注射后即出現(xiàn)向損傷對側(左側)旋轉,計數(shù) 10min,以 5min內累計≥20轉,視為成功的偏側 PD大鼠模型。對照組為假手術組,手術方法與模型組大鼠相同,注射等量的生理鹽水。

3 電生理記錄和放電形式分析 電生理記錄在SNc損毀后第 3周進行,記錄同側 m PFC錐體神經(jīng)元的電活動。大鼠用 20%的烏拉坦(1.2g/kg,i.p.)麻醉后將頭固定于腦立體定位儀上,右側 mPFC的位置:前囟 +2.7～3.4 mm,矢狀縫右旁開 0.5～0.7 mm,顱骨膜下 1.5～ 4.0 mm。采用玻璃微電極細胞外記錄方法在體記錄大鼠 m PFC的神經(jīng)元放電。電極尖端直徑1～ 2 μ m,阻抗 10～ 30M Ω,充灌液為 0.5M/L醋酸鈉含 2%滂胺天藍。細胞放電經(jīng) MEZ-8201微電極放大器,顯示于 VC-10記憶示波器,以觀察電位波形和細胞放電形式,同時信號輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽。將信噪比大于3∶1的、穩(wěn)定的單細胞放電經(jīng)生物電信號采集與分析系統(tǒng)進入計算機后,作實時觀察、儲存和進行頻率及放電形式的分析,采樣時間 5～ 10min。整個實驗過程中監(jiān)測大鼠心電,肛溫維持在(37±0.5)℃。根據(jù)放電間隔直方圖(ISIH),并結合原始放電序列,將神經(jīng)元的放電形式分為以下 3種類型:①規(guī)則放電:ISIH呈對稱分布;②不規(guī)則放電:ISIH呈隨機不對稱分部;③爆發(fā)式放電:ISIH呈逐漸衰減的正偏態(tài)分布。每一個 ISIH的生成最少包含 500個連續(xù)的動作電位,bin寬 4ms。另外,根據(jù) ISIH計算出平均放電間隔的變異系數(shù)。變異系數(shù)是放電間隔的標準差與平均放電間隔之比,反映神經(jīng)元電活動的規(guī)則程度。

4 免疫組織化學實驗 ①標本采集:20%烏拉坦(1.2g/kg體重)過量腹腔麻醉。自胸骨處 V形剪開胸腔暴露心臟,輕牽心臟自左心室插入粗針頭,迅速剪開右心耳,先以 37℃ 0.2%肝素生理鹽水 100ml快速灌注,繼以 4℃含 4%多聚甲醛的 0.1mol/L PBS液(pH7.4)先快后慢灌注固定。自枕骨大孔處開顱取出完整的腦組織。隨后置于 4%多聚甲醛溶液于 4℃冰箱中固定 3～ 4h后放入 20%蔗糖溶液過夜至沉底。用冰凍切片機切制連續(xù)冠狀切片,片厚 30 μ m,置于 0.01 mol/L PBS中。②免疫組織化學染色:切片在 0.01 mol/L PBS(pH7.4)中漂洗后入 0.3%Triton X-100的 0.01 mol/L PBS中浸泡 30 min(室溫 ),而后按ABC法,進行免疫組織化學染色:切片分別入兔抗 5-HT1A單抗(濃度 1∶1500以抗體稀釋液即 5%正常羊血清+ 0.3%Triton-100 in PBS稀釋)4℃下孵育48h;然后再入生物素標記的山羊抗兔 IgG(1∶500,Sigma),4℃ 24h;最后入辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素復合物(S-A/HRP)中室溫孵育 2h;以上每一步驟之后均用 0.01 mol/L PBS液充分漂洗 3次,每次 10 min;用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法呈色反應 15 min。染色的切片漂洗后裱片、晾干、脫水、透明、封固。每批染色設置空白對照以 PBS緩沖液代替一抗進行。③圖像分析:在明視野顯微鏡下認定 mPFC結構單位,以含棕黃色顆粒者為陽性細胞,經(jīng) HPLAS-100型全自動醫(yī)學彩色圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下計數(shù) m PFC的陽性細胞,結合 Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞進行計數(shù)統(tǒng)計,每組標本取 5個(距前囟 3.2mm)陽性表達部位測定后取平均值。

5 統(tǒng)計學處理 應用 SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析處理,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示,組間比較采用方差分析(One-way ANOV A);放電頻率的比較使用 Student’s t檢驗,變異系數(shù)的比較使用Mann-Whitney U檢驗,放電形式的比較使用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 對照組和 PD組大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元電活動的比較 對照組大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元的放電頻率為 1.25± 0.09Hz(n=32),變異系數(shù)為 0.54± 0.05,其放電形式表現(xiàn)為不規(guī)則放電和爆發(fā)式放電兩種,前者占 78%,后者占 22%。PD組大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元放電頻率為 2.41± 0.19Hz(n=48),變異系數(shù)是 0.76±0.06,放電形式同樣為兩種,68%為爆發(fā)式放電,32%為不規(guī)則放電。與對照組相比,PD組的放電頻率明顯增加,變異系數(shù)明顯增高,爆發(fā)式放電比例顯著升高。 見圖 1。

圖1 對照組與 PD組大鼠 mPFC內神經(jīng)元放電頻率和放電形式的比較

圖2 5-HT1A受體細胞內的分布 (×400)

圖3 大鼠 mPFC神經(jīng)元 5-HT1A表達(×200)

圖4 對照組和 PD組大鼠 mPFC的分層情況Ⅰ～Ⅵ (×200)

2 大鼠 mPFC5-HT1A受體表達的變化 大鼠mPFC中 5-HT1A受體的表達主要集中在 5-HT能神經(jīng)元的胞體和樹突上,見圖 2。對照組大鼠 mPFC部位表達比較豐富的 5-HT1A陽性細胞,而 PD模型大鼠損毀側 m PFC部位 5-HT1A受體陽性細胞則明顯稀疏,與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05),見圖 3。大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元各層 5-HT1A受體表達的變化顯示,對照組大鼠和 PD組大鼠 m PFC的Ⅰ層均無5-HT1A受體的表達,對照組大鼠 m PFC的Ⅱ～Ⅵ層5-HT1A受體陽性細胞表達比較豐富,PD組大鼠mPFC的Ⅱ層 5-HT1A受體陽性細胞表達也較豐富,但Ⅲ～Ⅵ表達明顯稀疏。見圖 4。

3 大鼠 mPFC內 5-HT1A受體陽性表達細胞計數(shù)的比較 PD模型大鼠損毀側 mPFC內 5-HT1A受體陽性表達細胞數(shù)目明顯減少,與未損毀側及正常對照組和相比均有顯著差異(P＜0.05),而未損毀側mPFC內 5-HT1A受體陽性表達細胞計數(shù)與正常對照組相比無明顯變化(P＞0.05)。見附表。

附表 各組大鼠 mPFC5-HT1A受體陽性細胞計數(shù)結果

附表 各組大鼠 mPFC5-HT1A受體陽性細胞計數(shù)結果

注:對照組與 PD組比較 P＜0.05

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討 論

已知 mPFC在情緒調節(jié)和認知活動,特別是注意力和記憶過程起重要作用。mPFC中有高密度的 5-HT轉運體和多種 5-HT受體亞型表達[5],以 5-HT1A受體亞型居多。5-HT1A受體位于胞體和樹突上,具有自身受體的特性,對遞質的釋放和神經(jīng)元的活動起著復雜的調節(jié)作用[6]。 5-HT1A受體通過 G蛋白和 K+離子通道相耦聯(lián),使神經(jīng)元產生超極化,從而抑制神經(jīng)元的電活動[7,8]。

本實驗結果顯示 SNc偏側損毀后大鼠損毀側m PFC內 5-HT1A受體陽性細胞表達數(shù)目明顯減少,其原因可能為黑質-紋狀體通路變性導致 m PFC內 5-HT1A受體缺失或表達 5-HT1A受體的神經(jīng)元變性死亡。Frechilla報道在 MPTP誘導的 PD猴子模型中,m PFC和海馬腦區(qū)的 5-HT1A受體密度,以及細胞外5-HT遞質濃度都有所降低,在 PD患者和 M PT P誘導的 PD猴子模型中,縫核、前額葉皮層和海馬結構中5-HT1A受體的結合位點明顯降低[9]。我們的研究結果與其一致。這些均證實了黑質-紋狀體通路變性可導致 5-HT遞質系統(tǒng)發(fā)生結構和功能上的改變,包括 5-HT能神經(jīng)元的減少和多種 5-HT受體亞型的功能失調。本實驗觀察到 PD組大鼠 mPFC的Ⅰ層與對照組相同,均無 5-HT1A受體的表達,而 PD組Ⅲ -Ⅵ層 5-HT1A受體陽性細胞表達明顯稀疏,提示在 PD狀態(tài)下 mPFC的Ⅲ -Ⅵ層內 5-HT1A受體缺失或表達受體的神經(jīng)元變性死亡受損最為明顯。

本研究顯示,6-OHDA損毀大鼠的 SNc后,mPFC錐體神經(jīng)元放電頻率明顯增多,放電形式趨向爆發(fā)式放電,說明 PD狀態(tài)下 mPFC錐體神經(jīng)元呈過度電活動,其原因可能為,mPFC主要接受腹側被蓋區(qū)的 DA神經(jīng)纖維傳入,并且表達 D1和 D2受體。Carman等發(fā)現(xiàn)損毀大鼠的 SNc后,腹側被蓋區(qū)中的 DA能神經(jīng)元平均丟失 32%[10]。 因此,6-OHDA損毀 SNc后,導致了腹側被蓋區(qū)中 DA能神經(jīng)元的變性,從而使 mPFC錐體和中間神經(jīng)元上 DA受體表達減少,導致了錐體神經(jīng)元的去抑制。其次,m PFC中 50%～ 60%的錐體神經(jīng)元和 20%～30%的中間神經(jīng)元上有 5-HT1A受體的表達。5-HT1A受體通過 G蛋白與 K+通道耦聯(lián),激活 5-HT1A受體,使細胞膜產生超極化,從而降低神經(jīng)元的活動。刺激縫核和中縫背核可以通過激活 5-HT1A受體而抑制 mPFC中錐體神經(jīng)元的電活動[11],黑質-紋狀體通路變性導致 mPFC中 5-HT1A受體表達下降,進而導致錐體神經(jīng)元的電活動增強。因此,我們推測腹側被蓋區(qū)中 DA能神經(jīng)元的喪失、m PFC中DA含量降低和 5-HT1A受體表達的減少,與錐體神經(jīng)元的電活動增強密切相關。我們課題組的研究還顯示[12],與對照組大鼠相比,在 PD組大鼠,體循環(huán)給予選擇性 5-HT1A受體激動劑 8-OH-DPAT只有在高劑量時才能夠抑制錐體神經(jīng)元的放電頻率,并且沒有興奮-抑制作用的出現(xiàn);mPFC中局部應用 8-OH-DPAT不能改變神經(jīng)元的電活動。這些結果進一步支持黑質-紋狀體通路變性導致了 5-HT1A受體功能失調或 /和受體表達的降低。因此,本實驗結果有助我們更為深入的理解 PD狀態(tài)下 mPFC的作用,以及 5-HT系統(tǒng)在PD非運動系統(tǒng)癥狀的發(fā)生機制和病理生理變化、以及進一步尋找有效治療手段方面具有重要的作用。

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