西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(西安 710061) 郭世文 張 熙 尉春艷

目前研究發(fā)現(xiàn),在一些高度惡性腫瘤中存在一種特殊的血液供應(yīng)方式,它沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞參與,代之以內(nèi)皮化的腫瘤細(xì)胞,這種血液供應(yīng)方式被稱為血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM)。目前在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài),如黑色素瘤,肝癌,卵巢癌等。膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,治療效果不佳,患者大多在術(shù)后 2年內(nèi)死亡。本研究通過對(duì)Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SHG44以及Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的三維培養(yǎng)并利用 HE染色和免疫組織化學(xué)技術(shù)和組織化學(xué)(CD34-PAS)雙重染色技術(shù)觀察不同惡性程度人腦膠質(zhì)瘤石蠟切片,確定膠質(zhì)瘤中是否存在血管生成擬態(tài)及其與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系。

材料與方法

1 材 料 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞由 ATCC(American type culture collection)提供,SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)外科研究所提供,鼠尾膠原蛋白Ⅰ型購自生友生物技術(shù)有限公司,85例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、第二附屬醫(yī)院2002～ 2009年手術(shù)存檔石蠟標(biāo)本,術(shù)后均經(jīng)病理診斷證實(shí)為膠質(zhì)瘤,包括 65例星形細(xì)胞瘤,8例髓母細(xì)胞瘤,7例室管膜母細(xì)胞瘤,5例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤。其中Ⅰ級(jí) 12例 ,Ⅱ 級(jí) 17例,Ⅲ 級(jí) 18例 ,Ⅳ級(jí) 38例。

2 方 法 ①細(xì)胞的三維培養(yǎng):將 200 μ l鼠尾膠原蛋白加到置于冰浴的離心管中,加入 690 μ l無菌水,然后加到 12 μ l的 0.1mol/L NaOH中,再加入 100 μ l的 10× PBS,混勻后加入到 24孔板中,每孔加入100 μ l,室溫下放置 30min,待膠凝固后,每孔加入 U87細(xì)胞 1× 104,常規(guī)培養(yǎng) 48h。 將 SHG44細(xì)胞設(shè)為缺氧組及對(duì)照組,制膠方法同前,待膠凝固后,每孔加入SHG44細(xì)胞 1×104,缺氧組加入二氯化鈷(CoCl2)100 μ mol/L,常規(guī)培養(yǎng) 72h。 ② HE染色和免疫組織化學(xué)與組織化學(xué)雙重染色方法:免疫組織化學(xué)采用 SP法,按照 CD34免疫組化試劑盒步驟操作,顯微鏡下觀察,血管內(nèi)皮呈現(xiàn)棕黃色后,蒸餾水沖洗 1min終止顯色反應(yīng);將切片置于 0.5%的過碘酸溶液中氧化15min;蒸餾水沖洗 2次,每次 3min,然后置于 Schiff液中,避光環(huán)境下 PAS反應(yīng) 15min;蒸餾水洗 3次,每次 1min,流水沖洗 3min,蘇木靜染色 5min,流水沖洗2min,分化 ,反藍(lán) ,常規(guī)脫水 ,透明 ,樹膠封片。

3 結(jié)果判定 腫瘤細(xì)胞彼此融合,連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為形成擬態(tài)血管。腫瘤組織中出現(xiàn) CD34陰性,PAS染色陽性管道且管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞為擬態(tài)血管。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。用卡方檢驗(yàn),t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 膠質(zhì)瘤瘤細(xì)胞株 U87及 SHG44三維培養(yǎng)結(jié)果 觀察 U87細(xì)胞培養(yǎng) 48h后可見細(xì)胞變長且相互融合,連接成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)(圖 1)。在對(duì)照組中,SHG44培養(yǎng) 72h后生長紊亂,無明顯規(guī)律,但是在缺氧組中,SHG44互相連接,形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。

圖1 U87細(xì)胞及 SHG44的三維培養(yǎng)結(jié)果 (×100)

2 CD34-PAS雙重染色 所有膠質(zhì)瘤免疫組織化學(xué)染色可見血管內(nèi)皮 CD34陽性,其中 14例標(biāo)本可見 CD34陰性,PAS染色陽性管道,管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞(圖 2,3)。

圖2 星形細(xì)胞瘤的 HE染色

圖3 星形細(xì)胞瘤組織免疫組織化學(xué)和組織化學(xué)雙重染色(×100)

3 膠質(zhì)瘤分級(jí)與血管生成擬態(tài)的關(guān)系 Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中未發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài),Ⅱ～Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)3例血管生成擬態(tài)陽性,陽性率為 8.6%(3/35),與Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤組相比,兩者具有顯著性差異(P＜0.05),Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn) 11例血管生成擬態(tài)陽性,陽性率為28.9%(11/38),與Ⅱ～Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤組(P＜0.05)及Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤組(P＜0.01)相比,均有顯著性差異。

討 論

目前的研究發(fā)現(xiàn),在一些高度惡性腫瘤中,腫瘤細(xì)胞可以通過自身變形及與基質(zhì)的重塑形成特殊的微循環(huán)結(jié)構(gòu),向腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì),這種微循環(huán)結(jié)構(gòu)被稱為血管生成擬態(tài)[1]。血管生成擬態(tài)不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞,不同于傳統(tǒng)的腫瘤血管結(jié)構(gòu),是傳統(tǒng)血管生成理論的重要補(bǔ)充。它不但能向腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)以滿足腫瘤快速生長的需要,還能增加腫瘤與血液直接接觸的機(jī)會(huì),使腫瘤極易侵襲及轉(zhuǎn)移[2]。血管生成擬態(tài)的形成機(jī)制還不十分清楚,目前認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞中多種蛋白異常表達(dá)相關(guān),如缺氧誘導(dǎo)因子-α(HIF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等[3]。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象,如黑色素瘤,卵巢癌,乳腺癌,肝癌,胃腺癌等[4～6],但是在膠質(zhì)瘤中,特別是不同惡性程度的膠質(zhì)瘤中是否存在血管生成擬態(tài)尚無定論。明確在膠質(zhì)瘤中是否存在血管生成擬態(tài),對(duì)于改善膠質(zhì)瘤的治療效果具有重要的意義。

本研究采用三維培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 SHG44以及Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U87,發(fā)現(xiàn)U87在常規(guī)培養(yǎng)下即能相互連接,形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),SHG44細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)下則生長序列紊亂,無明顯規(guī)律。但是當(dāng)我們使 SHG44細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí),SHG44細(xì)胞則呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性,也能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這說明在腫瘤的生長過程中,膠質(zhì)瘤中可能存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象,并且Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞更易出現(xiàn)擬態(tài)血管。但是,血管生成擬態(tài)并不是Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞所特有,在特定的條件下,如缺氧條件下,Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞也存在血管生成擬態(tài)。膠質(zhì)瘤組織的 CD34-PAS雙染結(jié)果也證實(shí)了這種觀點(diǎn),在Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤和Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤中我們均發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài),Ⅳ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)陽性率顯著高于Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤(P＜0.05),Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤血管生成擬態(tài)陽性率與Ⅰ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤相比,兩者也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。因此,血管生成擬態(tài)可能和膠質(zhì)瘤的惡行程度密切相關(guān)。

分析Ⅱ～Ⅲ級(jí)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在缺氧條件下形成血管生成擬態(tài)的原因,我們認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下 HIF-α蛋白、VEGF蛋白、MMP-2蛋白、MM P-9蛋白的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。抑制腫瘤的血管生成是目前腫瘤治療的重要研究方向。目前的血管抑制治療大多以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn),如果僅僅針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,腫瘤組織內(nèi)就會(huì)處于缺氧狀態(tài)[7],腫瘤細(xì)胞可能相互連接形成血管生成擬態(tài),為腫瘤提供營養(yǎng),導(dǎo)致治療失敗。如何能同時(shí)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管以及擬態(tài)血管,可能會(huì)成為腫瘤血管抑制治療成功的關(guān)鍵。

[1] Maniotis AJ,Folberg R,Hess A,et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and vitro:vasculogenic mimicry[J].Am J Pathol,1999,155(3):739-752.

[2] 蘇 敏,豐有吉,堯良清,等.卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3可塑性形成擬態(tài)血管的體內(nèi)研究 [J].復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2007,34(3):329-334.

[3] Yvette W JP,Patricia MMB,Soetekouw MWV,et al.Signalling pathways in vasculogenic mimicry[J].Biochim Biophys Acta,2010,1806(1):18-28.

[4] Su M,Feng YJ,Yao LQ,et al.Plasticity of ovarian cancer cell SKOV3ip and vasculogenic mimicry in vivo[J].Int J Gynecol Cancer,2008,18:476-486.

[5] Baocun S,Shuo QMS,ZhangSW,et al.Role and mechanism of vasculogenic mimicry in gastrointestinal stromal tumors[J].Human Pathology,2008,39:444-451.

[6] 趙 靜,黃江生,楊愛軍,等.肝細(xì)胞癌中血管生成擬態(tài)的三維細(xì)胞培養(yǎng)及組織學(xué)研究[J].癌癥,2007,26(2):123-126.

[7] Saidi A,Javerzat S,Bellahcene A,et al.Experimental anti-angiogenesis causes upregulation of genes associated with poor survival in glioblastoma[J].Int J Cancer,2008,122(10):2187-2198.