成都市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗院 周 浩 李俊霞 楊 紅 肖全偉

四環(huán)素類是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，主要包括四環(huán)素、土霉素、金霉素等，由于具備抗菌譜廣以及價格低廉等優(yōu)點，已被廣泛應用于畜禽、水生動物和蜜蜂養(yǎng)殖中（賈久滿等，2007）。四環(huán)素類抗生素對于呼吸道和消化道疾病有很好的預防作用，促進生長作用效果較好，但容易被消化道吸收而殘留在畜禽產(chǎn)品中，因此會嚴重危及人類的身體健康。四環(huán)素類藥物的毒性反應主要表現(xiàn)在對胃、腸、肝臟、腎臟的損害以及對牙齒和骨骼的破壞，最顯著的殘留毒性是誘導耐藥菌株的產(chǎn)生（李俊所等，2002）。目前四環(huán)素類抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯(lián)免疫方法、高效液相色譜法和質譜聯(lián)用法 （閆小峰，2010；杜紅鴿等，2008；王晶等，2002）等，雖然這些方法都準確可靠，但成本昂貴，前處理繁瑣復雜，檢測時間較長，無法縮短陰性樣品的檢測時間，遠不能滿足大批量樣品快速檢測的需要；放射免疫法結合了微生物法的準確與免疫法的高效，可用來快速篩選飼料中四環(huán)素族藥物殘留。本實驗旨在建立一種可靠、特異性強的放射免疫法用于飼料中四環(huán)素類抗生素的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

1.1.1 儀器和設備 Charm II 7600分析儀，渦旋振蕩器，電熱恒溫器，專用硼硅玻璃試管及試管塞，精密pH試紙（5.0～10.0），離心機，微量移液器等。

1.1.2 試劑 四環(huán)素類抗生素檢測試劑盒及閃爍液，提取緩沖溶液，多抗標準品，緩沖液M2、陰性組織提取物，以上試劑均由Charm公司試劑盒提供。

四環(huán)素類藥物標準品：四環(huán)素、土霉素、金霉素、氯霉素、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、青霉素G等標準品，以上標準品均購于Sigma公司。

1.1.3 試驗樣品 市場購買飼料20組，四環(huán)素類抗生素留檢陽性樣品10組及陰性樣品40組。

1.2 方法

1.2.1 測試原理 放射免疫原理基于兩個方面，其一：每類抗生素族均是在一個母環(huán)基礎上用不同的功能團修飾形成特定功效的抗生素。其二：微生物細胞表面都存在著能與抗生素功能基團結合的特異受體（王晶等，2002）。因此該法測定的基礎是競爭性受體免疫反應，使用兩種試劑:一種是被[3H］標記的四環(huán)素，另一種是四環(huán)素藥物結合試劑（微生物細胞上的特異性受體）。當樣品中含有四環(huán)素類抗生素殘留時，殘留物與結合試劑受體上的結合位點結合，從而阻止了[3H］標記的四環(huán)素與結合位點的結合。[3H］標記的四環(huán)素結合越多，則樣品中四環(huán)素類抗生素殘留越少。用液體閃爍計數(shù)儀測定樣品中的[3H］的（每分鐘脈沖數(shù)）[cpm]值，cpm值越大，樣品中的四環(huán)素類抗生素殘留量越低（陸勤等，2007；鄭晶等，2005）。

1.2.2 樣品處理 稱取1 g飼料于帶蓋樣品管，做好標記；加10 mL MSU提取緩沖液至樣品管中，旋渦振蕩15 s。用pH試紙測試pH值，滴加M2緩沖液，直到將pH值調至7.5，此液為待測液。

1.2.3 測定步驟 取出檢測試劑盒，用壓桿將白色藥片（微生物受體）推出到空的試管中；用加液器取300 μL溫水至管中，用旋渦振蕩混合10 s將藥片打碎；用移液器加5 mL樣品，接著將橙色藥片（[3H］標記的四環(huán)素抗體）推至試管中；用混合器混合15 s；在36℃的孵育器孵育5 min；將離心機調至4000 r/min離心5 min；立即小心棄去上清液，將測試管邊緣的水珠擦干；加300 μL溫水，用旋渦振蕩混合10 s將沉淀物打碎；加3 mL閃爍液至試管中，加蓋，混勻，靜置1 min。在CharmⅡ7600分析儀的[3H］頻道進行60 s計數(shù)，將測得結果與控制點比較，如果樣品cpm值大于控制點，則判為陰性；如果樣品cpm值小于或等于控制點，應判定為初篩陽性。

1.2.4 控制點的確定 首先用LC-MS方法確定6組飼料中四環(huán)素類殘留陰性樣品，選陰性樣品加標濃度為50 μg/kg作為控制點。在6份陰性樣品中分別加入標準溶液，形成樣品中四環(huán)素類含量50 μg/kg，用1.2.2方法進行提取后，按照1.2.3的步驟進行測定，得出6個cpm值，計算其平均值。考慮提取過程中的回收以及防止假陰性出現(xiàn)，因此控制點的cpm值確定在平均值的基礎上上調15%，即控制點cpm 值＝平均值×（1＋15%）。

1.2.5 陽性結果的確定 當樣品cpm值小于控制點cpm值時，應首先同時測定一個陰性質控和一個陽性質控，測試的陽性質控應該小于控制點，以確定試劑和設備工作正常，再重新平行取樣檢測。如果重測樣品的cpm小于控制點，且試劑和設備正常，則判定樣品初篩陽性。改用LC-MS法進行確定。

1.2.6 交叉反應 分別將氯霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、青霉素G、阿莫西林、磺胺嘧啶、紅霉素、螺旋霉素標準儲備液，添加到陰性樣品中，配成含單一抗生素以及多種抗生素濃度為1000 μg/kg的飼料樣品，樣品處理及檢測方法同1.2.2和1.2.3。

2 結果與分析

2.1 標準曲線 將金霉素標準品添加入四環(huán)素陰性飼料樣品中，使飼料的金霉素添加濃度分別為 20、50、80、100、150、200、250、300、350、400 μg/kg，按1.2.3中測定步驟檢測其cpm值，結果見表1。

由于在CharmⅡ放射免疫分析中作為受體的細菌和被[3H］標記的抗原的量是固定的，因此當樣品中競爭性抗原濃度增加時其競爭效率下降，Δcpm逐漸減少。

表1 金霉素添加濃度與cpm值的關系

2.2 加標實驗 用50 μg/kg篩選水平，分別空白添加四環(huán)素、土霉素、金霉素以及它們混合標準，混標 1：土霉素∶四環(huán)素∶金霉素=4∶3∶3，混標 2：四環(huán)素∶土霉素∶金霉素=4∶3∶3，混標 3：金霉素∶土霉素∶四環(huán)素=4∶3∶3。 結果見表 2。

表2 篩選水平50 μg/kg的樣品加標實驗陽性檢出率 %

從表2可以看出，無論是單標還是混標，在50 μg/kg篩選水平實驗中結果均為陽性。

2.3 比對實驗 在對用LC-MS法檢測結束的50組留檢樣品，其中四環(huán)素類（總量大于50 μg/kg）陽性留檢樣品10組及陰性樣品40組，用放射免疫法分析，結果見表3。

2.4 應用檢測 以50 μg/kg作為篩選濃度，對20組市場購買的飼料進行篩選，其結果見表4。

表3 放射免疫法與LC-MS法對50組樣品分析符合情況

表4 飼料中四環(huán)素類抗生素殘留測定

用LC-MS方法驗證5、10、18號樣品的四環(huán)素類殘留總量結果分別為 161.4、70.5、284.1 μg/kg；同時驗證其余陰性樣品，測定結果均小于50 μg/kg。表明應用情況良好，篩選結果可靠。

2.5 交叉反應 經(jīng)過多次反復對1.2.6中其他族抗生素加標試驗，與控制點cpm值進行比較，結果均為陰性。表明CharmⅡ四環(huán)素類抗生素放射免疫檢測法特異性強，與本族以外的抗生素無交叉反應。

3 小結

目前在日常檢測中陽性樣品很少，因此檢測發(fā)展的趨勢是快速區(qū)分陽性與陰性樣品。CharmⅡ放射免疫分析法是結合微生物學與免疫學各自的特點發(fā)展起來的。放射免疫檢測法具有操作簡單、速度快、分析成本低的優(yōu)點，是目前使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法，該法適用于大量樣品的篩選。飼料樣品前處理簡單、干擾因素小，只需簡單處理便可檢測，從接收樣品到出結果，整個過程大約20 min。陰性結果不但表明該樣品中含四環(huán)素族單種抗生素濃度分別小于50 μg/kg，同時也可表明，四環(huán)素族濃度總和不超過50 μg/kg。所以，CharmⅡ放射免疫法提供了一種很好的飼料中多種四環(huán)素類藥物檢測的快速篩選方法。

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