劉濤 白石 胡海濤

1 西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系（西安 710068） 2 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖與組織胚胎學(xué)系

衰老患者神經(jīng)細(xì)胞凋亡可引起其學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重下降［1，2］，因此，減緩或阻止神經(jīng)元凋亡是治療老年性疾病如阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’ s disease,AD)和帕金森氏?。≒arkinson’s disease, PD）的重要手段。一些神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子（NGF），通過與其相應(yīng)受體結(jié)合能激活細(xì)胞存活通路，如磷脂酸肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）信號(hào)通路，PI3-K通路的下游分子Akt（又稱蛋白激酶B）及B細(xì)胞淋巴癌/白血病 -2（B-cell lymphomia/leukemia-2，Bcl-2） 是 促細(xì)胞存活，阻止細(xì)胞凋亡的重要分子［3］。因此，通過促進(jìn)腦內(nèi)源性神經(jīng)生長因子的表達(dá)，進(jìn)而激活細(xì)胞存活通路，對(duì)受損神經(jīng)元進(jìn)行修復(fù)是目前治療老年性疾病的熱點(diǎn)研究之一。近年來國內(nèi)外對(duì)長期適宜負(fù)荷運(yùn)動(dòng)（包括跑臺(tái)、轉(zhuǎn)籠或游泳運(yùn)動(dòng)）對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明長期適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)可使大鼠腦內(nèi)神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）等表達(dá)量顯著增加，同時(shí)大鼠的空間學(xué)習(xí)能力也加強(qiáng)［4，5］。但目前針對(duì)運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)及其下游信號(hào)通路影響的研究還較少，尤其是運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠神經(jīng)生長因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用及其下游信號(hào)分子的影響機(jī)制還不明確，而針對(duì)中等負(fù)荷游泳訓(xùn)練對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老模型的Akt信號(hào)通路上、下游分子影響的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。所以本研究通過注射D-半乳糖制作大鼠衰老模型，觀察6周中等負(fù)荷游泳訓(xùn)練后衰老大鼠的行為學(xué)特征、海馬神經(jīng)元凋亡情況及腦內(nèi)NGF及其下游Akt信號(hào)分子的表達(dá)，探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)衰老大鼠腦功能影響的機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)延緩衰老和防治老年性疾病的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性2月齡SD大鼠30只，體重213±14g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)SCXK（陜）2007-003。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境室溫（23±1）℃，濕度45%～75%，自然光照。大鼠游泳池為90 cm×70 cm×60 cm的透明玻璃器皿，水深50 cm，水溫（33±1）℃。實(shí)驗(yàn)前，隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照組（normal control group，NC組）、衰老模型對(duì)照組（aging control group，AC組）、衰老模型訓(xùn)練組（aging exercise group，AE組）3組，每組10只。

1.2 動(dòng)物模型的建立

正常對(duì)照組（NC組）按常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)，每日在頸背皮下注射1次生理鹽水（125 mg/kg），共6周。衰老模型對(duì)照組（AC組）常規(guī)喂養(yǎng)，自由活動(dòng)，每日在頸背皮下注射1次D-半乳糖（125 mg/kg），共6周。衰老模型訓(xùn)練組（AE組）常規(guī)喂養(yǎng)，每日在頸背皮下注射D-半乳糖（125 mg/kg），共6周［6］，并從第1周開始無負(fù)重游泳訓(xùn)練，第1天游泳30 min，以后每天增加10 min，直至90 min后保持不變，每周訓(xùn)練5天，周四、周日休息，共訓(xùn)練6周。每次訓(xùn)練結(jié)束后，動(dòng)物均能自己抖干身上的水，無疲勞癥狀出現(xiàn)。

1.3 大鼠行為學(xué)測(cè)試

第7周，采用Morris水迷宮（荷蘭NOLDUS公司ETHOVISON軌跡記錄分析系統(tǒng)）對(duì)3組大鼠進(jìn)行定位航行和空間探索行為實(shí)驗(yàn)，判斷其學(xué)習(xí)記憶和空間記憶的認(rèn)知能力。①定位航行實(shí)驗(yàn)：共5天，將大鼠從標(biāo)記的4個(gè)入水點(diǎn)依次朝向池壁輕輕放入水中，記錄大鼠在120s內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)所用時(shí)間，即逃避潛伏期。②空間探索實(shí)驗(yàn)：在定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即第6天進(jìn)行，撤除平臺(tái)，將大鼠放入水池，記錄大鼠在120s內(nèi)穿越平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，AE組有2只死亡，剩8只大鼠。

1.4 海馬CA3區(qū)TUNEL染色

水迷宮測(cè)試全部結(jié)束后24 h，各組隨機(jī)取3只進(jìn)行TUNEL染色。大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（60 mg/kg），經(jīng)升主動(dòng)脈灌注肝素化生理鹽水150 ml，4%多聚甲醛400 ml灌注。參照大鼠腦立體定位圖譜，切取左側(cè)海馬置于4%多聚甲醛溶液中后固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。取石蠟切片冠狀面連續(xù)切片（厚5 μm），切片放入60℃烤箱烤12 h。切片脫蠟至水，PBS漂洗5 min×2次，2%蛋白酶K 50μl室溫孵育30 min，PBS漂洗5 min×2次，3% H2O2室溫下封閉 10 min，PBS漂洗 5 min×2次，濾紙吸干；加50 μl TdT反應(yīng)液37℃避光反應(yīng)60 min；PBS漂洗5 min×3次，濾紙吸干；加50 μl Streptavidin-HRP工作液，37℃避光反應(yīng)30 min；PBS漂洗5 min×3次，加TUNEL染液，每片加50μl，37℃避光反應(yīng)45 min；PBS漂洗5 min×3次，熒光封片液封片，蓋上蓋玻片，指甲油封好蓋玻片，倒置熒光顯微鏡（Olympus，Japan）下觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞質(zhì)被染成綠色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。對(duì)各組每張切片分別取5個(gè)視野進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，熒光顯微鏡拍照。TUNEL檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.5 Western Blot 檢測(cè)

3組大鼠隨機(jī)各取5只，用10%水合氯醛腹腔麻醉，立即斷頭取腦。切取海馬置于預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中充分勻漿后冰上靜置30 min；沸水中煮5 min；冰上冷卻5 min；以12000g轉(zhuǎn)速于4℃離心30 min；棄沉淀，留上清液。取小部分上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度，剩余上清液分裝，置-80 ℃冰箱待用。等量蛋白樣品（50 μg）經(jīng)12.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔多抗NGF（1:1000，Santa Cruz）、兔多抗 Phospho-Akt（Ser473）、Akt（1:2000，Cell Signaling Technology）、兔多抗 Bcl-2、Bax（1:500，Santa Cruz）及兔單抗-action（1:1000，Santa Cruz）室溫孵育1 h后，4℃過夜；TBST洗膜10 min ×3次，分別加入相應(yīng)的HRP結(jié)合的羊抗兔IgG（1:2000，Pierce）室溫孵育1 h；TBST洗10 min ×3次，加入ECL發(fā)光液1 min后于暗室內(nèi)進(jìn)行膠片曝光、顯影、定影、晾干。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，-actin作為內(nèi)參照。以目的條帶與內(nèi)參的吸光度比值表示蛋白表達(dá)。應(yīng)用Bandscan.5.0進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

表1顯示，各組大鼠在5天的游泳訓(xùn)練中對(duì)尋找平臺(tái)均有一定的學(xué)習(xí)記憶能力，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長，大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。從第3天開始，與NC組相比，AC組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P <0.01），與AC組相比，訓(xùn)練第4天、第5天AE組大鼠逃避潛伏期顯著縮短（P < 0.01）。

表1 定位航行試驗(yàn)中三組大鼠逃避潛伏期比較（s）

空間探索試驗(yàn)中，NC組、AC組和AE組跨越平臺(tái)次數(shù)分別為10.79±1.21、5.93±0.94與8.48±0.82。經(jīng)雙因素方差分析，與NC組比較，AC組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯降低（P < 0.01）；與AC組比較，AE組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P < 0.01）。

2.2 大鼠海馬CA3區(qū)TUNEL染色結(jié)果

圖1顯示：NC組海馬CA3區(qū)凋亡細(xì)胞少，AC組綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。表2顯示，與NC組比較，AC組海馬CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加（P< 0.01），AE組顯著少于AC組（P < 0.01）。

2.3 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果

圖2～圖4顯示，與NC組比較，AC組NGF、P-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P < 0.01）；與AC組相比，AE組NGF、P-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加（P < 0.01）。3組Akt表達(dá)無明顯差異（P> 0.05）；與NC組比較，AC組Bax蛋白表達(dá)顯著增加（P < 0.01），與AC組相比，AE組Bax蛋白表達(dá)顯著減少（P < 0.01）。

表2 3組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)（n = 3）

3 討論

注射D-半乳糖致亞急性衰老大鼠模型是抗衰老研究的較好模型之一［7］。青年大鼠長期注射D-半乳糖后由于其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，代謝紊亂，體內(nèi)活性氧水平升高，細(xì)胞膜脂質(zhì)受損，以致產(chǎn)生機(jī)體多器官、多系統(tǒng)的功能衰退，這些變化和自然衰老的變化一致。Morris水迷宮是通過讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)在水中尋找隱藏平臺(tái)并通過分析其尋找平臺(tái)所用時(shí)間和所走路徑測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置覺和方向覺（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力，進(jìn)而判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物記憶功能好壞的一種行為學(xué)測(cè)試方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，注射D-半乳糖所致衰老大鼠逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，說明在本實(shí)驗(yàn)中，注射D-半乳糖可致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。而與安靜衰老大鼠比較，經(jīng)6周游泳訓(xùn)練的衰老大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明6周游泳負(fù)荷訓(xùn)練可以提高衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［6，8，9］一致，因此長期適宜的體力活動(dòng)可以改善衰老引起的認(rèn)知功能低下和學(xué)習(xí)記憶能力降低。

海馬是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最密切的解剖結(jié)構(gòu)。衰老的病理變化主要表現(xiàn)為廣泛的大腦皮層神經(jīng)元喪失，尤其是海馬和基底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)生退化［10］。神經(jīng)細(xì)胞在衰老過程中的死亡主要是以凋亡形式發(fā)生的，神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的突觸丟失是記憶功能障礙最主要的原因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射D-半乳糖可引起大量海馬神經(jīng)元凋亡，而6周游泳訓(xùn)練可減少D-半乳糖引起的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，表現(xiàn)為TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，說明6周的游泳訓(xùn)練對(duì)海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用。Chae等［11］研究指出，8周中等負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練可有效降低海馬神經(jīng)元凋亡率。而田野等［12］提出，過度負(fù)荷游泳訓(xùn)練可使大鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性改變。這說明運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的控制對(duì)其影響海馬神經(jīng)元是一個(gè)關(guān)鍵。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，NGF可促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元生長、分化和生存。外源性NGF可恢復(fù)因年齡因素引起的膽堿能神經(jīng)元的損害，從而改善衰老大鼠的記憶［13，14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，衰老大鼠海馬神經(jīng)元NGF表達(dá)明顯降低，而6周游泳訓(xùn)練可明顯增加衰老大鼠NGF表達(dá)量，說明6周游泳訓(xùn)練可增加本實(shí)驗(yàn)衰老大鼠海馬內(nèi)源性NGF表達(dá)。Chae等［15］對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行中等負(fù)荷的跑臺(tái)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)NGF表達(dá)明顯增加。Neeper等［16］研究結(jié)果表明在7天自愿轉(zhuǎn)籠運(yùn)動(dòng)后大鼠海馬NGF表達(dá)迅速顯著增加。以上研究表明，NGF變化與運(yùn)動(dòng)刺激密切相關(guān)，適宜負(fù)荷的運(yùn)動(dòng)可以增加NGF分泌，促進(jìn)受損神經(jīng)元功能的恢復(fù)。NGF等生長因子與其細(xì)胞膜表面相應(yīng)受體結(jié)合后可以激活一些細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，PI3-K/Akt信號(hào)通路是其中之一。PI3-K被NGF等胞外信號(hào)活化后，激活下游蛋白激酶Akt，活化的Akt可促進(jìn)凋亡基因失活，從而抑制神經(jīng)元凋亡以及促進(jìn)神經(jīng)元的存活［17］。Vaillant等［18］發(fā)現(xiàn) Akt能維持 NGF 誘導(dǎo)的交感神經(jīng)元的存活。本實(shí)驗(yàn)觀察到AC組海馬神經(jīng)元P-Akt表達(dá)明顯低于NC組，6周游泳訓(xùn)練后AE組P-Akt表達(dá)明顯高于AC組，這說明6周游泳訓(xùn)練可以提高衰老大鼠海馬神經(jīng)元磷酸化Akt水平，已有研究［17，19］表明，Akt只有在磷酸化狀態(tài)下才能發(fā)揮其活性作用。而本實(shí)驗(yàn)中3組海馬神經(jīng)元非磷酸化Akt表達(dá)無顯著性差異。丁樹哲等［20］研究指出，耐力訓(xùn)練可以增加衰老小鼠心肌Akt mRNA表達(dá)，從而提高衰老小鼠心肌細(xì)胞蛋白合成效率。Chen［21］等對(duì)大鼠進(jìn)行2周的自愿轉(zhuǎn)籠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，伴隨著BDNF表達(dá)的增加，磷酸化Akt表達(dá)也增加。

Bcl-2是Akt信號(hào)通路的下游分子之一。關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)Bcl-2家族蛋白影響的研究較多，Kang等［22］指出16周的跑臺(tái)訓(xùn)練可上調(diào)AD模型大鼠腦內(nèi)Bcl-2的表達(dá)，并下調(diào)Bax的表達(dá)。張鈞等［23］指出長期中等強(qiáng)度訓(xùn)練可提高大鼠心肌中Bcl-2 mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，6周游泳訓(xùn)練明顯提高衰老大鼠海馬Bcl-2表達(dá)水平，同時(shí)降低Bax表達(dá)。我們認(rèn)為其機(jī)制可能是6周的游泳訓(xùn)練增加了大鼠內(nèi)源性NGF表達(dá)，增加的NGF與其相應(yīng)受體結(jié)合后激活細(xì)胞存活通路PI3k/Akt，活化的Akt磷酸化Bad，進(jìn)而增加Bcl-2表達(dá)，同時(shí)抑制Bax表達(dá)，起到抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用。

4 總結(jié)

注射D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型大鼠進(jìn)行6周游泳訓(xùn)練后，其逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，同時(shí)海馬神經(jīng)元凋亡明顯改善，可能是運(yùn)動(dòng)通過增加大鼠海馬內(nèi)源性NGF產(chǎn)生，激活PI3K/Akt通路，導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)增加，降低Bax表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)元存活。

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