張勁松，欒春業(yè)，王 強(qiáng)，徐 艷，張 晶，環(huán) 飛，程 潔，肖 杭

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診中心，江蘇南京 210029;2.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，山東濱州 256603;3.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院神經(jīng)毒理研究室，江蘇南京 210029)

代森錳鋅(mancozeb)屬含錳的乙烯基二硫代氨基甲酸鹽類殺菌劑，主要成分為代森錳，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物［1］，通過(guò)干擾體內(nèi)正常激素的作用，影響諸多系統(tǒng)和器官的功能。研究顯示，長(zhǎng)期暴露于代森錳鋅可能與帕金森等神經(jīng)退化性疾病相關(guān)［2］，體外培養(yǎng)中腦腦片暴露于代森錳鋅10～50 μmol·L－1能濃度依賴性地降低多巴胺能神經(jīng)元以及GABA神經(jīng)元的活力［3］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也觀察到代森錳鋅染毒大鼠多巴胺能神經(jīng)元凋亡［4］，但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PC-12細(xì)胞作為多巴胺能神經(jīng)元體外模型，觀察代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞凋亡的影響，探討代森錳鋅誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

PC-12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞所;代森錳鋅購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;各種規(guī)格培養(yǎng)皿為 Corning Costar產(chǎn)品;Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自日本同仁公司;流式細(xì)胞術(shù)FITC-AnnexinⅤ/PI試劑盒購(gòu)自南京聯(lián)科公司;DMEM購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清為杭州四季青產(chǎn)品;兔抗鼠p-ERK1/2一抗為 CST產(chǎn)品;Bcl-2和Bax購(gòu)自南京凱基公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。BX50-FLA熒光顯微鏡為日本Tokyo公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及WST-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖和毒性分析

PC-12細(xì)胞1×105接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2，37℃恒溫條件下，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清和青霉素 100 kU·L－1及鏈霉素 100 mg·L－1高糖DMEM培養(yǎng)基中，顯微鏡下觀察細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。代森錳鋅用DMSO溶解，初濃度為2 mmol·L－1，使用時(shí)用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基稀釋到終濃度為 1，10，30，60，120 μmol·L－1，加入含有PC-12細(xì)胞的培養(yǎng)板中并標(biāo)記，設(shè)立對(duì)照組(二甲亞砜)和只含培養(yǎng)基的空白組，每組設(shè)3組復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書的步驟加入試劑，37℃孵育 1 h，多功能酶標(biāo)儀(TECON)檢測(cè)吸光度值(absorbance，A)，細(xì)胞抑制率 =1－〔(A實(shí)驗(yàn)－A空白)/(A對(duì)照－A空白)〕×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)

應(yīng)用Hoechst33258核染色結(jié)合熒光照相技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)改變，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，加入代森錳鋅50 μmol·L－1再培養(yǎng)24 h 后，PBS 洗2 次，加入固定液，然后加入 Hoechst33258(終濃度為 10 mg·L－1)，37℃避光染色 15 min，PBS 洗3 次，用熒光顯微鏡觀察，正常細(xì)胞核表現(xiàn)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，凋亡細(xì)胞核呈濃染致密固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-12細(xì)胞凋亡

按凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)消化處理，離心收集細(xì)胞，沉淀并加結(jié)合緩沖液后再加入FITC-AnnexinⅤ/PI，避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，凋亡分析軟件計(jì)算PC-12細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率，每一時(shí)相點(diǎn)重復(fù)檢測(cè)3次，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.5 Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集經(jīng)代森錳鋅 0，1，30 和 120 μmol·L－1染毒處理24 h后細(xì)胞沉淀，PBS洗2遍，加入裂解液，4℃搖床反應(yīng)30 min，10 625×g離心15 min后取上清，BCA法測(cè)定總蛋白含量。Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2以及p-ERK1/2蛋白表達(dá)，每孔上樣50 μg，15%體積分?jǐn)?shù)SDS-PAGE分離樣品。轉(zhuǎn)膜、封閉，將PVDF膜與溶于TBST中的一抗4℃過(guò)夜孵育，洗滌5 min×3次，將膜浸入1∶1000體積比的二抗稀釋液，室溫孵育1 h，洗滌30 min，ECL法顯影，拍攝圖片，結(jié)果在Gel-pro Analyzer圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行積分吸光度(integrated absorbance，IA)值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖1結(jié)果顯示，代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞具有毒性作用，且具有濃度依賴性，隨著代森錳鋅濃度增加，PC12細(xì)胞的抑制率升高，其中代森錳鋅120 μmol·L－1組細(xì)胞抑制率為高達(dá)(90±4)%。經(jīng) Hill方程曲線擬合，IC50為49.95 μmol·L－1，h 系數(shù)為5.57。

2.2 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞凋亡率的影響

表1結(jié)果顯示，代森錳鋅作用24 h能夠濃度依賴性地誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡。與正常對(duì)照組比較，代森錳鋅 30 μmol·L－1使 PC-12 細(xì)胞的早期凋亡率升高到(9.5 ±1.0)%(P ＜0.05)，代森錳鋅 1，30和120 μmol·L－1使PC-12細(xì)胞晚期凋亡率均明顯升高(P ＜0.05)。代森錳鋅 120 μmol·L－1晚期凋亡率最高達(dá)(94.2±3.9)%，與細(xì)胞增殖和毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖1 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞增殖和凋亡的影響.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-12 細(xì)胞，用代森錳鋅0，1，10，30，60 和120 μmol·L－1培養(yǎng)24 h，按說(shuō)明書要求加入CCK-8試劑，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值.細(xì)胞抑制率=1－〔(A實(shí)驗(yàn) －A空白)/(A對(duì)照 －A空白)〕×100%.±s，n=3.Fig.1 Effect of mancozeb on PC-12 cells proliferation.

表1 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1 Effect of mancozeb on apoptosis of PC-12 cells

2.3 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

正常對(duì)照組PC-12細(xì)胞表現(xiàn)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光(圖2A 和 C)，代森錳鋅50 μmol·L－1處理組細(xì)胞數(shù)量減少，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核濃染的凋亡細(xì)胞，呈致密固縮或顆粒狀熒光高倍鏡下可見(jiàn)胞核變形、膨大及核固縮、核小體形成(圖2B和D)。

2.4 代森錳鋅對(duì) PC12細(xì)胞 Bcl-2，Bax和p-ERK1/2表達(dá)的影響

圖3結(jié)果顯示，代森錳鋅使PC-12細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高(圖3A);代森錳鋅誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡過(guò)程中p-ERK1/2表達(dá)增高，代森錳鋅 120 μmol·L－1組 IA 分 別 為 128.0 ± 2.5 和178.4 ±4.0(圖3B)。

圖2 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞核形態(tài)的影響(Hoechst33258).A，C:正常對(duì)照組;B，D:代森錳鋅 50μmol·L－1組.A，B:×100;C，D:×1000.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-12細(xì)胞代森錳鋅處理24 h后，采用Hoechst33258染色后，倒置熒光顯微鏡隨機(jī)選取視野攝片，正常細(xì)胞核表現(xiàn)為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，凋亡細(xì)胞核呈濃染致密固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光。箭頭示胞核變形、膨大及核固縮、核小體形成。Fig.2 Effect of mancozeb on morphological changes of nucleus of PC-12 cells.

圖3 代森錳鋅對(duì)PC-12細(xì)胞Bcl-2，Bax(A)和p-ERK1/2(B)表達(dá)的影響.PC-12細(xì)胞經(jīng)代森錳鋅處理24 h后.條帶1～4分別為正常對(duì)照組，代森錳鋅1，30和120 μmol·L－1組.±s，n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，與相應(yīng)的對(duì)照組相比.Fig.3 Effect of mancozeb on the expression of Bcl-2，Bax，and p-ERK1/2 in PC-12 cells.

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體在內(nèi)外環(huán)境刺激下，啟動(dòng)自身機(jī)制，由基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過(guò)程，伴隨基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，細(xì)胞膜發(fā)泡，細(xì)胞器緊縮，凋亡小體形成與呈現(xiàn)“DNA階梯”電泳圖譜。常用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有很多［5］，主要包括形態(tài)學(xué)觀察，熒光素標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，DNA斷裂檢測(cè)法，凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)法以及線粒體內(nèi)跨膜電位和膜滲透性變化的檢測(cè)等。

Bcl-2家族是研究最早的與凋亡有關(guān)的基因，也是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族。線粒體功能異常致凋亡途徑與Bcl-2家族蛋有著密切關(guān)系。Bcl-2家族成員中的促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2，以異二聚體的形式存在于線粒體內(nèi)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，通過(guò)控制線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)凋亡激活物，如細(xì)胞色素c的釋放來(lái)影響細(xì)胞的狀態(tài)。Bcl-2水平的升高和Bax的降低表明細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，反之則對(duì)凋亡的抵抗性減弱。本研究結(jié)果顯示，代森錳鋅誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡過(guò)程中，可濃度依賴性地降低Bcl-2表達(dá)水平，增加Bax表達(dá)水平，Bcl-2和Bax的比值降低，說(shuō)明Bcl-2和Bax等蛋白參與了代森錳鋅誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡。FITC-AnnexinⅤ/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，早期凋亡和晚期凋亡率均增高，代森錳鋅120 μmol·L－1時(shí)以晚期凋亡為主，早期凋亡細(xì)胞較對(duì)照組減少，可能與高劑量促使更多的早期凋亡細(xì)胞發(fā)展為晚期凋亡有關(guān);Hoechst33258染色觀察PC-12細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，可見(jiàn)核膨大、固縮，以及染色質(zhì)邊集濃染、核小體形成等凋亡形態(tài)學(xué)特征。

ERK包括ERK1和ERK2，是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。磷酸化激活的ERKl/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)反應(yīng)。早期實(shí)驗(yàn)認(rèn)為ERK是一種存活因子，當(dāng)生長(zhǎng)因子喪失和應(yīng)用細(xì)胞毒性物質(zhì)時(shí)，ERK1/2活化，抑制凋亡。但這種對(duì)凋亡前期的保護(hù)作用依賴細(xì)胞類型、藥物種類以及其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的狀態(tài)。最近的研究發(fā)現(xiàn)ERK也是一種凋亡因子，ERK1/2激活伴隨 Bax的表達(dá)增加［5］，直接調(diào)控凋亡蛋白胱天蛋白酶3活化并誘發(fā)凋亡［6］。在去甲斑蝥素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中ERK活化是其凋亡的下游信號(hào)［7］，同時(shí)ERK被認(rèn)為參與了神經(jīng)元的退化［8］，持續(xù)緩慢地激活ERK并在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用［9］，與帕金森等慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。

代森錳鋅誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡中的作用機(jī)制具有復(fù)雜性和多樣性。已發(fā)現(xiàn)金屬錳能穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，但含錳的乙烯基二硫代氨基甲酸鹽類殺菌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，起主要作用的是乙烯基二硫代氨基甲酸鹽而不是錳［3］。Calviello等［10］發(fā)現(xiàn)代森錳鋅能引起細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷，雙向凝膠電泳發(fā)現(xiàn)各種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生變化［10］。而 Dias等［11］在觀察酵母菌對(duì)代森錳鋅的耐受性實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)代森錳鋅并不是直接的氧化自由基或者氧化誘導(dǎo)物，可能是通過(guò)其他途徑發(fā)揮作用。其他實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)代森錳鋅能干擾線粒體氧化呼吸，抑制線粒體的解偶聯(lián)過(guò)程，降低ATP含量，對(duì)多巴胺能神經(jīng)元以及GABA神經(jīng)元都具有損傷作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路可能參與代森錳鋅導(dǎo)致PC-12細(xì)胞的凋亡過(guò)程，ERK作為從胞膜到胞核間重要的信號(hào)蛋白，其高表達(dá)會(huì)引起下游信號(hào)蛋白的表達(dá)改變，破壞了細(xì)胞間促調(diào)亡和促存活因素間的平衡，導(dǎo)致細(xì)胞最終不同的結(jié)局。另外可能還有其他機(jī)制參與代森錳鋅誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡過(guò)程，因此需要對(duì)相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用做更全面深入的研究，明確其作用的具體分子機(jī)制，才能更好地為臨床預(yù)防和治療長(zhǎng)期暴露于代森錳鋅所導(dǎo)致的帕金森病等神經(jīng)退行性疾病提供依據(jù)。

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