趙 坡，許 軍，陳小兵，黃洪林，徐遠(yuǎn)成

(江西中醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)學(xué)科組，江西南昌 330004)

對(duì)氯苯氧異丁酸甲氧基苯丙烯酸酯{(E)-4-〔2-(4-chlorophenoxy)-2-methylpropanoyloxy〕-3-methoxyphenyl acrylic acid，AZ}，是以中藥活性成分阿魏酸為先導(dǎo)化合物所合成的阿魏酸衍生物，系經(jīng)過(guò)篩選得到的一種兼有降血脂和抗血栓作用的藥物，可以用作預(yù)防和治療高脂血癥與血栓［1］。本實(shí)驗(yàn)觀察AZ對(duì)小鼠的急性毒性反應(yīng)及其對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性反應(yīng)，以評(píng)價(jià)AZ的安全性，并為臨床劑量的擬定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由江西中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):SCXK(贛)2005-0001;SD種大鼠，雌雄各半，體重110～130 g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(贛)2005-0001。

1.2 藥物

AZ，由江西中醫(yī)學(xué)院藥物化學(xué)學(xué)科組提供，批號(hào):090805，使用前用 0.5%羧甲纖維素納(CMC-Na)生理鹽水溶液配制為混懸液，2～4℃冰箱避光保存。

1.3 主要儀器

Dimension RXL Max型全自動(dòng)生化分析儀，德國(guó)西門子公司;XT-1800i血細(xì)胞測(cè)定儀和CA-530血凝測(cè)試儀，日本東亞公司。

1.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)［2－3］

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定ig及ip給予AZ的劑量范圍。小鼠ig給予AZ的急性毒性劑量范圍為3000～1001 mg·kg－1，劑量公比為 0.76，分別為 3000，2280，1733，1317 和1001 mg·kg－1。取小鼠按性別和體質(zhì)量隨機(jī)分成6組，每組10只，溶媒對(duì)照組ig給予等體積0.5%CMC-Na生理鹽水溶液。小鼠 ip給予AZ 劑量為1600 ～983 mg·kg－1，劑量公比 0.85，分別為1600，1360，1156 和 983 mg·kg－1。小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，溶媒對(duì)照組ip給予等體積0.5%CMC-Na生理鹽水溶液，正常對(duì)照組ip給予等體積生理鹽水，給藥體積0.2 ml。給藥后立即觀察各組動(dòng)物毒性反應(yīng)的體征及死亡數(shù)目和時(shí)間，并連續(xù)觀察14 d。根據(jù)死亡情況使用SPSS13.0軟件計(jì)算LD50。

1.5 大鼠長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)［3］

1.5.1 分組

SD種大鼠，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性觀察2周，取一般狀況良好的大鼠80只，按性別體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠5只。AZ組大鼠 ig給予 AZ 500，291.7 和166.7 mg·kg－1，溶媒對(duì)照組ig給予等體積的0.5%CMC-Na生理鹽水溶液。每日1次，連續(xù)13周。末次給藥24 h后，每組選取10只大鼠(雌雄各半)，ip給予3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)，凝血時(shí)間和血液生化學(xué)指標(biāo);取主要臟器稱重并作病理組織學(xué)檢查。余下動(dòng)物停止給藥，正常飼養(yǎng)2周后，同法處理檢測(cè)上述指標(biāo)。每天觀察一般情況，每周稱重1次。

1.5.2 血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

取血于血液細(xì)胞分析儀上測(cè)定紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)、白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板(platelet，PLT)、淋巴細(xì)胞系和中性粒細(xì)胞等指標(biāo)，血凝測(cè)定儀上測(cè)定部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT);取血分離血清，全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alamine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate aminotransferase，AST)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白 (albumin，ALB)、總膽 紅素 (total bilirubin，T-Bil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Crea)、總膽固醇(total cholesterol，T-Cho)、葡萄糖(glucose，GLU)10項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)。

1.5.3 臟器系數(shù)和病理組織學(xué)檢查

大鼠放血處死后，主要臟器進(jìn)行全面尸檢，肉眼觀察各臟器有無(wú)病變異常情況;取心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、前列腺、子宮、卵巢和甲狀腺等14個(gè)臟器稱重，并計(jì)算臟器系數(shù);然后對(duì)上述主要臟器及胃、大腸、小腸、胰腺和脊髓等臟器用10%甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AZ對(duì)小鼠的急性毒性

小鼠ig和ip給予AZ約10 min后，出現(xiàn)自主活動(dòng)減少、呼吸困難和后肢伸展松弛等現(xiàn)象，部分小鼠有流淚現(xiàn)象，毒性反應(yīng)隨劑量減小而減輕。各組小鼠死亡多發(fā)生在給藥4～48 h，死亡小鼠立即尸檢，除ip給藥小鼠胃腸道有充血現(xiàn)象外，其他主要臟器無(wú)明顯異常。未死亡小鼠于給藥3 d后逐漸恢復(fù)正常。根據(jù)各組死亡分布情況計(jì)算得出小鼠ig及ip給予AZ的LD50分別為2053 mg·kg－1(95%置信區(qū)間為 1770 ～2438 mg·kg－1)和 1254 mg·kg－1(95%置信區(qū)間為1172～1341 mg·kg－1)。動(dòng)物死亡情況見(jiàn)表1和表2。

表1 ig給予對(duì)氯苯氧異丁酸甲氧基苯丙烯酸酯(AZ)對(duì)小鼠存活的影響Tab.1 Effect of(E)-4-〔2-(4-chlorophenoxy)-2-methylpropanoyloxy〕-3-methoxyphenyl acrylic acid(AZ)ig given on mice survival

表2 ip給予AZ對(duì)小鼠存活的影響Tab.2 Effect of AZ ip given on mice survival

2.2 AZ的大鼠長(zhǎng)期毒性

2.2.1 AZ對(duì)大鼠一般狀況和體質(zhì)量的影響

AZ給藥期間和停藥2周內(nèi)，各組大鼠行為活動(dòng)、外觀體征和進(jìn)食量及二便情況等狀況均正常，未出現(xiàn)因藥物毒性死亡現(xiàn)象。各給藥組大鼠體質(zhì)量變化與溶媒對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(表3)。

2.2.2 AZ對(duì)血液學(xué)指標(biāo)的影響

AZ組大鼠給藥13周及停藥2周后血液學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變(表4，表5)。

表3 AZ對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of AZ on body mass in rats

表4 AZ給藥13周后對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Tab.4 Effect of AZ for 13 weeks on hemotological indexes in rats

表5 AZ停藥2周后對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Tab.5 Effect of AZ on hemotological indexes 2 weeks after AZ was ig given in rats for 13 weeks

2.2.3 AZ對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

與溶媒對(duì)照組相比，給AZ 13周后，AZ 500 mg·kg－1組 ALT，AST 及 BUN(P ＜0.05，P ＜0.01)有顯著上升，AZ 291.7 mg·kg－1組 GOT 有顯著上升(P＜0.05)，但基本在在正常范圍內(nèi)(大鼠正常參考值為 83 U·L－1)［5］，AZ 500 和 291.7 mg·kg－1組T-CHO均顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01);各給藥組的其余指標(biāo)與對(duì)照組比較，均無(wú)顯著性差異(表6);停藥2周后，各給藥組生化學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，AZ 500 和 291.7 mg·kg－1組的異常指標(biāo)均恢復(fù)正常(表7)。

2.2.4 AZ對(duì)臟器系數(shù)的影響

給藥期和恢復(fù)期 AZ 500，291.7和 166.7 mg·kg－1組動(dòng)物處死后尸檢，肉眼觀察各臟器無(wú)明顯病變異常情況。與對(duì)照組相比，給藥13周后AZ 500 和 291.7 mg·kg－1組肝系數(shù)顯著升高(P ＜0.05)，停藥2 周后 AZ 500 和291.7 mg·kg－1組肝系數(shù)基本恢復(fù)正常。各給藥組其他主要臟器的臟器系數(shù)與對(duì)照組比較，均未見(jiàn)顯著性差異(表8，表9)。

2.2.5 AZ對(duì)大鼠臟器組織形態(tài)的影響

病理組織學(xué)檢查結(jié)果(圖1)顯示，AZ 500 mg·kg－1給藥13周后，發(fā)現(xiàn)1例肝組織匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。溶媒對(duì)照組和AZ 500 mg·kg－1組各發(fā)現(xiàn)1 例局部間質(zhì)性肺炎。AZ 291.7 和 166.7 mg·kg－1組大鼠其他各臟器組織形態(tài)學(xué)與溶媒對(duì)照組比較無(wú)差異，并未見(jiàn)與藥物毒性相關(guān)的明顯病變。

表6 AZ給藥13周對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響Tab.6 Effect of AZ ig given for 13 weeks on blood biochemical indeices in rats

表7 AZ停藥2周后大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的變化Tab.7 Blood biochemical indexes in rats 2 weeks after AZ administration

表8 AZ給藥13周后對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)的影響Tab.8 Effect of AZ ig given for 13 weeks on main organ coefficients in rats

表9 AZ停藥2周后對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)的影響Tab.9 Effect of AZ on organ coefficients in rats 2 weeks after AZ administration

圖1 AZ給藥13周后對(duì)大鼠肝組織形態(tài)的影響(×100).動(dòng)物分組給藥見(jiàn)表3.A:正常對(duì)照組;B:AZ 500 mg·kg－1組.Fig.1 Effects of AZ for 13 weeks on hepatic histopathology of rats(×100)

3 討論

通過(guò)急性毒性試驗(yàn)測(cè)出AZ的小鼠ig給藥途徑LD50為2053 mg·kg－1，根據(jù)化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該化合物為低毒級(jí)別，其LD50約為臨床擬定日劑量(8.3 mg·kg－1)的250 倍，顯示該化合物毒性較小且安全范圍較大。根據(jù)《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)的給藥途徑至少包括臨床擬用途徑和一種至少能使原型藥物較完全進(jìn)入循環(huán)的途徑。由于AZ水溶性較小，作靜脈注射制劑可行性不大，所以實(shí)驗(yàn)除采用經(jīng)口給藥途徑外使用腹腔注射給藥途徑。由于AZ難溶于水，微溶于乙醇，考慮到使用CMC-Na作為助懸劑，以水為分散介質(zhì)可使溶媒對(duì)急性毒性的影響更小，所以采用CMC-Na水溶液把供試品配成混懸液。另外實(shí)驗(yàn)中增加了CMC-Na生理鹽水溶液的溶媒對(duì)照組，結(jié)果顯示該溶媒對(duì)小鼠并無(wú)明顯毒性影響。

AZ的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)給藥AZ 13周及停藥2 周后，AZ 500，291.7 和166.7 mg·kg－1組大鼠均未見(jiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)。大鼠ig給予AZ 166.7 mg·kg－1(臨床擬定劑量20倍量)時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)與溶媒對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。AZ 500和291.7 mg·kg－1給藥13周后顯示有血清轉(zhuǎn)氨酶和及肝臟器系數(shù)升高現(xiàn)象，AZ 291.7 mg·kg－1組異常指標(biāo)基本在正常范圍內(nèi)，病理組織學(xué)檢查顯示僅高劑量組個(gè)別大鼠出現(xiàn)肝組織匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，推斷AZ 500 mg·kg－1對(duì)大鼠肝臟功能應(yīng)有損害作用，AZ 291.7 和166.7 mg·kg－1的肝毒性并不明顯。AZ 500 mg·kg－1組血清尿素氮水平雖有所升高，但基本在正常范圍內(nèi)［5］，同時(shí)血清肌酐未見(jiàn)明顯升高，腎臟臟器系數(shù)和腎臟組織病理學(xué)檢查也未見(jiàn)與給藥有關(guān)的異常，考慮到血清尿素氮的改變受多種因素影響，因此認(rèn)為AZ 500 mg·kg－1對(duì)腎功能的影響較小。停藥后肝腎損傷可逆，未見(jiàn)藥物延遲性毒性反應(yīng)。除對(duì)肝腎功能的影響外，AZ各劑量組大鼠均未見(jiàn)其他與給藥相關(guān)的明顯病變和毒性反應(yīng)。而藥效研究實(shí)驗(yàn)中大鼠給藥劑量分別為333.3，166.7 和83.3 mg·kg－1(為臨床擬用劑量的40倍、20倍和10倍［6］)，因此推斷AZ設(shè)定此臨床擬用劑量應(yīng)該有較好的安全性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AZ 500 和 291.7 mg·kg－1組T-CHO與溶媒對(duì)照組相比均顯著降低，說(shuō)明AZ 500 mg·kg－1能顯著降低正常大鼠血清 T-CHO，AZ 166.7 mg·kg－1時(shí)對(duì)血清 T-CHO 影響不顯著。本結(jié)果還顯示AZ對(duì)APTT無(wú)顯著影響。其原因是因?yàn)锳Z為阿魏酸結(jié)構(gòu)修飾物，主要是通過(guò)抑制血小板聚集發(fā)揮抗血栓作用［6］，而APTT測(cè)定的原理是以部分凝血活酶代替血小板因子Ⅲ，觀察乏血小板血漿凝固所需的時(shí)間，由此推斷AZ對(duì)APTT的影響不顯著應(yīng)屬于正常。AZ在毒性劑量下對(duì)正常動(dòng)物各項(xiàng)血脂指標(biāo)及凝血功能指標(biāo)的影響有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

［1］ 許 軍，彭 紅.阿魏酸酯及其制備方法和應(yīng)用［P］.CN03109056，7，2003.4.3.

［2］ 徐淑云，卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第2版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1202.

［3］ 《化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005.

［4］ 衛(wèi)生部藥政局.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編［S］.1993:198-201.

［5］ 孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:87.

［6］ 歐仕益，包惠燕，藍(lán)志東.阿魏酸及其衍生物的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中藥材，2001，24(3):220-221.