高 原，陳金妮，陳尚勤，蔡曉紅，陳國(guó)榮，林振浪

(1.浙江省金華市中心醫(yī)院兒科，浙江金華 321000;2.海南省人民醫(yī)院兒科，海南?？?570100;3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院，浙江溫州 325027;4.溫州醫(yī)學(xué)院附屬一院病理科，浙江溫州 325027)

鄰苯二甲酸二乙基己基酯 (diethylhexylphthalate，DEHP)是一種增塑劑，以往認(rèn)為其無(wú)毒，所以廣泛用于硬質(zhì)的乙烯聚合物(polyvinyl chloride，PVC)產(chǎn)品，如食物包裝袋、醫(yī)療設(shè)備、嬰兒玩具、建筑材料和日常用品等，同時(shí)也是膠黏劑、氣霧劑、涂料、印刷油墨和美容化妝品中的重要成分［1］。DEHP疏松地結(jié)合于PVC，在使用過(guò)程中以及隨著時(shí)間的推移，大多數(shù)DEHP釋放到環(huán)境中，且殘留期較長(zhǎng)，生物對(duì)其也有較強(qiáng)的富集作用。黃曉群等［2］測(cè)定人體血清中5種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物殘留量，以DEHP最高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEHP能通過(guò)胎盤(pán)［3］，孕鼠如暴露于 DEHP會(huì)導(dǎo)致下一代生殖系統(tǒng)損害［4－5］。DEHP對(duì)胚胎肺發(fā)育影響的研究較少，體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)，雞胎肺培養(yǎng)中加入DEHP會(huì)導(dǎo)致胚胎肺體積變小及發(fā)育不成熟［6］，但作用機(jī)制尚不清楚。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)對(duì)于胚胎期肺發(fā)育，尤其肺泡成熟起至關(guān)重要的調(diào)控作用，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2)是 MMP-2特異性天然抑制劑［7－8］。本研究觀察孕鼠染毒 DEHP后胎鼠肺發(fā)育情況及 DEHP對(duì) MMP-2，VEGF和 TIMP-2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

DEHP，純度99%，購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，批號(hào)CAS 117-81-7;MMP-2為鼠抗人單克隆抗體、TIMP-2為兔抗人多克隆抗體、VEGF為鼠抗人單克隆抗體、即用型非生物素免疫組化ElivisionTMplus檢測(cè)試劑盒和酶底物顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。MDF-328E型超低溫冰箱，日本Sanyo公司;1169型生物安全柜，美國(guó)Thermo Forma公司;液氮罐，溫州醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心;FA2104型電子分析天平，上海儀器設(shè)備廠;DSHZ-300恒溫水浴箱，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;KD-BM4生化組織包埋機(jī)，浙江科迪實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;V2088型超薄切片機(jī)，美國(guó)LKB公司;CX21FS1型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司;H-7500型透射電鏡，日本Hitach公司;Image Proplus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，美國(guó) Media Cybernetics公司。

1.2 動(dòng)物及分組處理

Sprague-Dawley大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2003-0003，于溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)。雌性體質(zhì)量為250～300 g，雌雄鼠按2∶1合籠交配，次日晨發(fā)現(xiàn)白色陰栓者為妊娠的第1天。孕鼠共34只，隨機(jī)分成4組，正常對(duì)照組每天ig給予0.5 ml玉米油，其他各組每天 ig給予0.5 ml含DEHP的玉米油，分別相當(dāng)于給予DEHP 10，100和750 mg·kg－1，至自然分娩，取第1 天仔鼠。

1.3 仔鼠體質(zhì)量測(cè)量和肺樣本制備

隨機(jī)取每只孕鼠的仔鼠3只，稱量體質(zhì)量，比較各組體質(zhì)量改變情況。再隨機(jī)取其中2只仔鼠，ip注射戊巴比妥鈉35 mg·kg－1麻醉后處死。取出肺組織，分離剪去肺門(mén)部大支氣管和血管，用25號(hào)針插入右肺支氣管，取4%甲醛用20 cm H2O的壓力灌注，固定，制備光鏡和免疫組化標(biāo)本。

1.4 光鏡觀察肺組織形態(tài)、測(cè)量輻射狀肺泡計(jì)數(shù)及肺間質(zhì)比例

將上述固定的右肺中葉組織，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片厚5 μm，HE染色，光鏡觀察肺病理形態(tài)學(xué)變化。每只仔鼠的肺樣本切片5張，每張切片隨機(jī)選擇6個(gè)視野，分別測(cè)量:① 輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(radical alveolar counts，RAC)，即呼吸性細(xì)支氣管中心至最近的纖維隔垂直線上的肺泡數(shù)目，取平均值，參考Jarfelt等［9］方法;② 肺間質(zhì)比例，去除切片中的大血管和支氣管，數(shù)字圖像分析技術(shù)分割圖片，調(diào)整照片到肺間質(zhì)和肺泡對(duì)比最強(qiáng)烈的像素閾值T，T=100，根據(jù)每個(gè)圖像位點(diǎn)的像素不同，分割圖片為肺間質(zhì)和肺泡，根據(jù)肺間質(zhì)的像素總和計(jì)算肺間質(zhì)的比例。

1.5 免疫組化法檢測(cè) MMP-2，TIMP-2和 VEGF的表達(dá)

將上述石蠟包埋的右肺中葉組織，每只仔鼠的肺樣本切片3張，石蠟切片脫蠟至水，按試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿中有棕黃色顆粒沉積。隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Image ProPlus 6.0圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性染色，采用吸光度值(absorbance，A)表示蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 孕鼠染毒鄰苯二甲酸二乙基己基酯對(duì)仔鼠體質(zhì)量的影響

DEHP 750 mg·kg－1組2 只孕鼠在第17、19 天發(fā)生流產(chǎn)，1只仔鼠死亡。每窩隨機(jī)取第1天出生的仔鼠3只，表1體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DEHP組仔鼠體質(zhì)量均下降(P＜0.01);DEHP 750 mg·kg－1組與 DEHP 10，和 100 mg·kg－1組相比體質(zhì)量下降明顯(P＜0.05)，說(shuō)明孕鼠染毒劑量越高，仔鼠體質(zhì)量減輕越明顯。

表1 孕鼠染毒鄰苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)對(duì)仔鼠的體質(zhì)量的影響Tab.1 Effec of di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)on body mass in rat pups

2.2 孕鼠染毒鄰苯二甲酸二乙基己基酯對(duì)仔鼠肺形態(tài)、輻射狀肺泡計(jì)數(shù)及肺間質(zhì)比例的影響

與正常對(duì)照組(圖1A)比較，在光鏡下，DEHP 10和100 mg·kg－1組肺泡形態(tài)發(fā)育無(wú)明顯改變，未見(jiàn)炎癥反應(yīng)、滲出及出血(圖1B，1C)，DEHP 750 mg·kg－1組可見(jiàn)肺間質(zhì)增厚，間質(zhì)細(xì)胞增多，肺泡數(shù)目減少，肺泡體積增大(圖1D)。與正常對(duì)照組相比，僅 DEHP 750 mg·kg－1組 RAC 減小，肺間質(zhì)比例增大(P ＜0.05)(表2)。

2.3 孕鼠染毒鄰苯二甲酸二乙基己基酯對(duì)仔鼠肺組織MMP-2，TIMP-2和VEGF表達(dá)的影響

圖1 孕鼠染毒DEHP對(duì)仔鼠肺形態(tài)的影響 (HE×100).孕鼠處理及仔鼠的選取見(jiàn)表1.A:正常對(duì)照;B:DEHP 10 mg·kg－1;C:DEHP 100 mg·kg－1，肺泡形態(tài)發(fā)育無(wú)明顯改變，未見(jiàn)炎癥反應(yīng)、滲出及出血;D:DEHP 750 mg·kg－1，肺間質(zhì)增厚，間質(zhì)細(xì)胞增多，肺泡數(shù)目減少.Fig.1 Effect of DEHP on lung histology in rat pups(HE ×100).

表2 孕鼠染毒DEHP對(duì)仔鼠輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)及肺間質(zhì)比例的影響Tab.2 Effect of DEHP on lung radical alveolar counting(RAC)and interstitial tissue proportion in rat pups

仔鼠肺組織中MMP-2的表達(dá)和MMP-2/TIMP-2比值隨孕鼠染毒DEHP劑量的增加而增多(P＜0.01)。與正常對(duì)照組相比，DEHP 100和 750 mg·kg－1組 TIMP-2 的表達(dá)減少(P ＜ 0.01);VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，圖2)。

圖2 孕鼠染毒DEHP對(duì)仔鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)(A)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)(B)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)(C)表達(dá)的影響(免疫組化 ×400).1:正常對(duì)照;2，3 和4:DEHP 10，100 和750 mg·kg－1組.Fig.2 Effcet of DEHP on the expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)(A)，tissue inhibitor of metalloproteinase-2(TIMP-2)(B)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in rat pups(C)(Immunohistochemistry ×400).

表3 孕鼠染毒DEHP對(duì)仔鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)比較Tab.3 Effect of DEHP on the expression of MMP-2，TIMP-2 and VEGF in rat pups

3 討論

本研究結(jié)果說(shuō)明，孕鼠染毒DEHP會(huì)影響胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育，影響的嚴(yán)重程度與染毒DEHP劑量的大小密切相關(guān)。以往研究表明，每天給予孕鼠DEHP≥750 mg·kg－1時(shí)，胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)受到影響［10－11］，而本研究中孕鼠染毒 DEHP 10 mg·kg－1時(shí)，胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育即受到抑制，這可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因和所處的環(huán)境不同有關(guān)，也可能是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身就存在較高的DEHP基礎(chǔ)暴露。具體原因有待進(jìn)一步研究。

Magliozzi等［12］報(bào)道，孕鼠從孕 15 d 至分娩后2 d每天飼以含 DEHP 1000 mg·kg－1的飼料，分娩后以乳汁喂養(yǎng)仔鼠，發(fā)現(xiàn)2日齡仔鼠肺泡數(shù)目減少，氣體交換面積減少。本研究中也發(fā)現(xiàn)隨孕鼠染毒DEHP劑量的增大，仔鼠肺實(shí)質(zhì)出現(xiàn)相似的變化。本實(shí)驗(yàn)還采用RAC和肺間質(zhì)比例，與光鏡下觀察到的病理改變一致，僅DEHP 750 mg·kg－1組的仔鼠肺間質(zhì)比例增大，RAC減小，說(shuō)明DEHP對(duì)鼠胎肺發(fā)育有抑制作用。孕鼠在分娩前1周開(kāi)始攝入含1%DEHP的飲食后，發(fā)現(xiàn)14日齡仔鼠肺泡簡(jiǎn)單化，氣體交換面積減少，間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞增生明顯［14］。

MMP-2和MMP-2/TIMP-2的平衡對(duì)肺發(fā)育起重要作用［7，14］。研究證實(shí)，在高氧暴露下，過(guò)度增強(qiáng)的MMP-2活性和MMP-2/TIMP-2表達(dá)失衡可阻滯肺泡發(fā)育，可能是新生大鼠高氧肺損傷的發(fā)生機(jī)制之一［7，15］。本研究中，仔鼠肺組織 MMP-2 的表達(dá)和MMP-2/TIMP-2比例隨孕鼠染毒DEHP的劑量增加而增加，DEHP 750 mg·kg－1組的仔鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變，提示在小劑量DEHP染毒劑量下，雖然MMP-2表達(dá)和MMP-2/TIMP-2比例有所增加，但在此表達(dá)水平時(shí)尚未引起肺形態(tài)學(xué)的改變;當(dāng)大劑量DEHP染毒時(shí)，MMP-2表達(dá)和MMP-2/TIMP-2比例增加達(dá)到一定程度，此時(shí)引起了仔鼠肺發(fā)育明顯的異常。與新生鼠高氧暴露肺損傷模型研究結(jié)果類似［7，15］。因此推測(cè) MMP-2 過(guò)度表達(dá)和 MMP-2/TIMP-2失衡可能是DEHP影響肺泡發(fā)育的作用機(jī)制之一。

肺泡和微血管充分發(fā)育，是肺發(fā)育的兩個(gè)重要方面，而肺內(nèi)血管生成是肺發(fā)育的關(guān)鍵。VEGF是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異絲裂原，在胎兒后期肺血管和肺泡的發(fā)育中起至關(guān)重要的作用［8］。本研究中仔鼠肺組織VEGF的表達(dá)并不隨孕鼠染毒DEHP的劑量增加而變化，而且與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明DEHP對(duì)肺發(fā)育的抑制可能并非通過(guò)影響VEGF表達(dá)這一途徑。

綜上所述，孕鼠染毒DEHP時(shí)對(duì)胚胎生長(zhǎng)有抑制作用，抑制程度與劑量成正比，在高劑量下會(huì)抑制胎肺發(fā)育，其作用機(jī)制可能與MMP-2過(guò)度表達(dá)和MMP-2/TIMP-2平衡關(guān)系的破壞有關(guān)。

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