敬海明，劉建中，高文暉，趙超英，馬 玲，李國(guó)君(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069;.北京市疾病預(yù)防控制中心北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心北京市食物中毒診斷溯源技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013)

錳是機(jī)體所必需的一種微量元素，但過(guò)量可引起暴露時(shí)又可引起多巴胺能神經(jīng)元的損傷，對(duì)其機(jī)制的探討，一直以來(lái)都是人們研究的熱點(diǎn)。尤其是近年來(lái)，甲基環(huán)戊二烯三羰基錳(methyl－cyclopentadienyl－manganese－tricarbonyl，MMT)作為汽油添加劑的使用而引起的大氣錳(MnCl2)污染日益嚴(yán)重，逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)長(zhǎng)期低劑量錳暴露研究的重視［1］。有研究報(bào)道稱(chēng)，血錳過(guò)高時(shí)主要通過(guò)由脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞所形成的血－腦脊液屏障(blood－cerebrospinal fluid barrier，BCB)向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)［2］。BCB 作為錳過(guò)量暴露時(shí)向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要途徑，其損傷發(fā)生在多巴胺能神經(jīng)元之前，研究并掌握錳早期對(duì)于BCB的毒性損傷作用及其機(jī)制，可以為今后制定職業(yè)與環(huán)境因素錳及其化合物所致神經(jīng)退行性疾病的早期有效防治措施提供理論依據(jù)。本研究通過(guò)觀察脈絡(luò)叢組織的病理形態(tài)學(xué)改變及BCB的損傷指標(biāo)腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)白蛋白指數(shù)［3］探討氯化錳對(duì)脈絡(luò)叢(choroid plexus，CP)的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

MnCl2，純度＞99%，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;白蛋白測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所);蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(南京建成生物工程研究所);KT－354大鼠微量白蛋白ELISA試劑盒(美國(guó)Kamiya生物公司);680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio－Rad公司);SCOT－Ⅱ BT224型半自動(dòng)生化分析儀(意大利Biotecnica公司);CH30生物相差顯微鏡(日本Olympus公司);圖像采集分析軟件UV－G顯微粒度分析系統(tǒng)(北京和眾視野科技有限公司);JEM－1230透射電子顯微鏡(日本Jeol公司);石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、展片機(jī)與自動(dòng)染色機(jī)均為L(zhǎng)eica公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組與處理

60只5周齡大的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，115～135 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK－1(軍)2007－004，隨機(jī)分成 6 組，每組 10只，分別為氯化錳30 d組、氯化錳90 d組及氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組與相應(yīng)的對(duì)照組(氯化錳30 d對(duì)照組、氯化錳90 d對(duì)照組、氯化錳90 d+30 d恢復(fù)對(duì)照組)。氯化錳組 ip給予無(wú)水氯化錳 6 mg(Mn)·kg－1染毒，每周染毒 6 d，周日停染，相應(yīng)的對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水處理。

1.3 樣本采集

各時(shí)間點(diǎn)染毒結(jié)束后，經(jīng)腹腔麻醉后消毒頸部皮膚，用0.45 mm×20 mm的蝶形針經(jīng)環(huán)枕膜穿刺待有落空感時(shí)見(jiàn)清亮CSF流出，以注射器輕抽CSF約100 μl注入預(yù)冷的Eppendorf管;從下腔靜脈抽取血液6～8 ml，注入無(wú)肝素處理的血液收集管，室溫放置至少0.5 h，600×g離心30 min，分離血清;采集實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組動(dòng)物雙側(cè)側(cè)腦室的脈絡(luò)叢組織。

1.4 血清白蛋白(SALB)與腦脊液白蛋白(CALB)的檢測(cè)及CALB指數(shù)的計(jì)算

SALB采用溴甲酚綠法在BT224型半自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定，CALB采用大鼠微量白蛋白ELISA試劑盒按說(shuō)明書(shū)操作后以全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，CALB指數(shù)=CALB/(SALB×10－3)。

1.5 光鏡、電鏡下觀察脈絡(luò)叢細(xì)胞形態(tài)

各組取3只大鼠的脈絡(luò)叢用生理鹽水徹底沖洗后合并，常規(guī)的4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，制作成病理切片標(biāo)本，每組至少10張，光鏡下觀察組織和細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 透射電鏡觀察脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

各組分別將2只大鼠的脈絡(luò)叢用2.5%戊二醛固定，再用1%鋨酸后固定，通過(guò)丙酮系列(30%，50%，70%，90%，100%)脫水，包埋在 Epon812中，制成超薄切片，用檸檬酸鉛及醋酸鈾染色，在透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化(每組至少觀察5張)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 錳對(duì)大鼠腦脊液白蛋白，血清白蛋白及腦脊液白蛋白指數(shù)的影響

氯化錳組CALB與CALB指數(shù)與其相應(yīng)的對(duì)照組比較均明顯升高(P＜0.05);氯化錳30 d組的CALB與CALB指數(shù)低于氯化錳90 d和氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，氯化錳90 d組CALB與CALB指數(shù)低于氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 錳對(duì)大鼠腦脊液白蛋白(CALB)，血清白蛋白(SALB)及腦脊液白蛋白(CALB)指數(shù)的影響Tab.1 Effect of manganese on CSF albumin(CALB)，serum albumin(SALB)and CSF albumin index(CALB index)in rats

2.2 錳對(duì)大鼠脈絡(luò)叢組織及上皮細(xì)胞形態(tài)的影響

各對(duì)照組脈絡(luò)叢組織結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大而圓，染色質(zhì)均勻，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)染色較淺，細(xì)胞基底部可見(jiàn)毛細(xì)血管(圖1A)。染氯化錳30 d后，脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的排列開(kāi)始出現(xiàn)紊亂，有的細(xì)胞核濃染變形，可見(jiàn)細(xì)胞腫大現(xiàn)象，脈絡(luò)叢上皮與其基底部的血管之間部分脫落(圖1B)。染氯化錳90 d后脈絡(luò)叢組織混亂，上皮細(xì)胞之間界限不清，細(xì)胞核大小不一，有的缺失，胞漿絮狀，血管與上皮之間完全脫落(圖1C)。染氯化錳90 d后無(wú)處理觀察30 d后脈絡(luò)叢組織的改變更加明顯，細(xì)胞萎縮，胞膜不清，細(xì)胞核發(fā)生濃縮、碎裂、溶解等，類(lèi)似于“凋亡細(xì)胞”的死亡現(xiàn)象，細(xì)胞間的連接部分消失等(圖1D)。由此可見(jiàn)，隨染氯化錳時(shí)間的延長(zhǎng)脈絡(luò)叢的損傷性改變逐漸加重，并且在脫離氯化錳接觸30 d后仍然表現(xiàn)為損傷持續(xù)性加重的特征。

2.3 錳對(duì)大鼠脈絡(luò)叢細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 錳對(duì)大鼠脈絡(luò)叢病理組織學(xué)的影響 (HE ×100).分組處理見(jiàn)表1.A:氯化錳30 d對(duì)照組;B:氯化錳30 d組，脈絡(luò)叢上皮扁平，細(xì)胞排列紊亂;C:氯化錳90 d組，脈絡(luò)叢組織形態(tài)模糊不清，細(xì)胞核大小不一，有的缺失;D:氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，細(xì)胞胞膜不清，胞核濃縮、溶解，細(xì)胞間連接模糊.Fig.1 Effect of manganese on histopathological changes in choroid plexus of rats(HE ×100).

如圖2～圖4所示，各對(duì)照組側(cè)腦室的脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞正常，核大而圓，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體豐富，上皮細(xì)胞間近游離端可見(jiàn)完整的緊密連接結(jié)構(gòu)，并且上皮細(xì)胞游離端多不規(guī)則，自質(zhì)膜衍生出許多微絨毛，排列整齊，上皮下為富含毛細(xì)血管的基質(zhì)。各氯化錳處理組脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞均發(fā)生不同程度的改變，表現(xiàn)為暗細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞核濃縮深染，核膜皺縮變形，細(xì)胞質(zhì)空泡增加，微絨毛缺失，溶酶體增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，以及細(xì)胞間緊密連接間隙變寬、斷裂，甚至消失，隨染氯化錳時(shí)間延長(zhǎng)，損害加重，并在脫離氯化錳接觸30 d后仍有進(jìn)行性加重的趨勢(shì)，呈現(xiàn)出氯化錳毒性病程依賴(lài)性模式。

圖2 錳對(duì)大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞細(xì)胞核(N)、線(xiàn)粒體(M)與溶酶體(L)的影響.分組處理見(jiàn)表1.A:氯化錳30 d對(duì)照組;B:氯化錳30 d組，胞核變小，核膜皺縮變形，線(xiàn)粒體空泡樣改變，溶酶體破裂變小;C:氯化錳90 d組，胞核皺縮變形，線(xiàn)粒體空泡樣改變，嵴有脫落現(xiàn)象，溶酶體破裂變小;D:氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，核膜皺縮，染色質(zhì)濃染，似凋亡，線(xiàn)粒體腫大，嵴脫落，可見(jiàn)大量空泡，溶酶體增加.Fig.2 Effect of manganese on nucleus(N)，mitochondria(M)and lysosome(L)in choroid plexus epithelia of rats.

圖3 錳對(duì)大鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞微絨毛(MV)的影響.分組處理見(jiàn)表1.A:氯化錳30 d對(duì)照組;B:氯化錳30 d組微絨毛腫大;C:氯化錳90 d組微絨毛排列紊亂;D:氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組微絨毛缺失，排列紊亂.Fig.3 Effect of manganese on microvilli(MV)in choroid plexus epithelia of rats.

3 討論

BCB主要是由室管膜內(nèi)陷于第三、四腦室與側(cè)腦室分化形成的脈絡(luò)叢組織上皮細(xì)胞間的緊密連接所構(gòu)成，專(zhuān)司外周血循環(huán)與CSF循環(huán)之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)［4］。脈絡(luò)叢組織由脈絡(luò)叢上皮與富含有窗毛細(xì)血管的基質(zhì)構(gòu)成，其上皮細(xì)胞是立方形或矮柱形細(xì)胞，細(xì)胞表面有許多微絨毛，細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線(xiàn)粒體［5］。脈絡(luò)叢上皮為一具有活性的界面，不僅可以通過(guò)其表面的微絨毛分泌CSF，而且在保護(hù)腦組織免受一些血液中的內(nèi)源性與外源性有害物質(zhì)損害方面也起著非常重要的作用［4］。當(dāng)血液中的有毒物質(zhì)(如重金屬氯化錳等)水平增高時(shí)，脈絡(luò)叢可以通過(guò)結(jié)合蓄集的方式阻止其進(jìn)入CSF［6］。但是，脈絡(luò)叢對(duì)外源性物質(zhì)的結(jié)合能力是有限的，當(dāng)有毒活性物質(zhì)蓄積到一定量時(shí)便會(huì)破壞脈絡(luò)叢的結(jié)構(gòu)和功能［7］，血清中有毒金屬與非金屬離子就失去了結(jié)合位點(diǎn)而不受限制地進(jìn)入CSF［8］，使神經(jīng)系統(tǒng)的代謝及功能發(fā)生紊亂，并引起一系列神經(jīng)生理生化改變。

本研究應(yīng)用光鏡與透射電鏡觀察了氯化錳對(duì)脈絡(luò)叢的病理形態(tài)學(xué)影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)叢是氯化錳過(guò)量暴露時(shí)一個(gè)重要的靶部位，氯化錳可致脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞發(fā)生不規(guī)則萎縮變小，微絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、縮短，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡、核質(zhì)凝聚，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞之間的緊密連接出現(xiàn)部分?jǐn)嗔雅c消失等，并且這些改變隨染氯化錳時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為加重的趨勢(shì)，即使在恢復(fù)期仍可進(jìn)行性加重。說(shuō)明錳可以蓄積在脈絡(luò)叢中，且脈絡(luò)叢蓄積錳的作用有一定的限度，當(dāng)超過(guò)限度時(shí)，可引起脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)變化影響其屏障功能完整性。

CSF中約90%的成分來(lái)源于脈絡(luò)叢組織的分泌［9］。腦脊液對(duì)腦組織具有支持、保護(hù)與營(yíng)養(yǎng)作用，正常生理狀態(tài)下，其成分受BCB的嚴(yán)格調(diào)控而保持相對(duì)穩(wěn)定，但是，在腦組織發(fā)生老化以及神經(jīng)退行性疾病時(shí)CSF中的一些血源性蛋白分子含量會(huì)增加，可以作為反映BCB損傷的指數(shù)［10］，如CSF白蛋白指數(shù)等［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染氯化錳可以引起CALB濃度以及CALB指數(shù)升高，升高水平與染氯化錳時(shí)間長(zhǎng)短以及脈絡(luò)叢組織的病理結(jié)構(gòu)改變呈正相關(guān)，說(shuō)明CALB濃度及CALB指數(shù)可以作為判斷氯化錳對(duì)BCB損傷程度的參考指標(biāo)，可以為今后制定作為職業(yè)與環(huán)境因素的氯化錳及其化合物所致神經(jīng)退行性疾病的早期有效防治措施提供理論依據(jù)。

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