楊向東，楊文華，史哲新，劉寶山，高 宏，張 蕾，陳艷鑫

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，天津 300193)

蝎毒多肽抑制白血病干細胞龕內(nèi)活化的實驗研究*

楊向東，楊文華，史哲新，劉寶山，高 宏，張 蕾，陳艷鑫

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，天津 300193)

[目的]觀察蝎毒多肽（PESV）抑制白血病干細胞（LSC）在骨髓龕內(nèi)的活化效應(yīng)。[方法]分離白血病/急性淋巴細胞白血病（AML/ALL）患者LSC，置于Transwell小室中，分為高中低劑量組及對照組，分別加入不同濃度蝎毒多肽后培養(yǎng)，計算不同濃度組及不同時間段的LSC遷移率。[結(jié)果]PESV組遷移率分別為（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%，與對照組（49.10±6.12）%比較差異具有顯著性（P<0.05），高劑量組遷移率高于中低劑量組。[結(jié)論]不同濃度PESV均有抑制白血病干細胞活化作用，抑制強度呈濃度依賴。

蝎毒多肽；白血病干細胞；龕；活化效應(yīng)

隨著白血病治療方法不斷進步，治愈白血病面臨最大問題不是如何獲得骨髓形態(tài)學(xué)緩解，而是如何清除患者體內(nèi)白血病干細胞（LSC）。筆者研究的蝎毒多肽（PESV）是從東亞鉗蝎蝎毒中分離和純化的提取物，是一種細胞毒成分，具有較強的協(xié)同化療藥物殺傷白血病干細胞作用。近年研究表明其協(xié)同作用機制之一是抗白血病干細胞多藥耐藥。

1 材料

1.1 標(biāo)本及白血病干細胞株 2010年1—12月，本院收治的初發(fā)及復(fù)發(fā)急性白血?。ˋL）患者35例，男 19 例，女 16 例，平均年齡 39.6（14～80）歲。急性非淋巴細胞白血?。ˋNLL）23例（其中慢性粒細胞白血病急粒變 6 例，ANLL－M53例，ANLL－M210 例，ANLL－M44例），急性淋巴細胞白血?。ˋLL）12例。初發(fā)21例，復(fù)發(fā)14例（復(fù)發(fā)患者至少半個月以上未用化療）。無菌操作留取骨髓標(biāo)本各3m L，肝素抗凝，經(jīng)磁珠分離法分離白血病干細胞，用RPMI－1640培養(yǎng)液重新懸浮細胞，調(diào)整濃度至2×106個/mL備用。

1.2 PESV的制備及鑒定 利用分子篩層析技術(shù)對蝎毒凍干粉分離提取，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰。應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）儀，LC/MS聯(lián)用技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)，蝎毒多肽提取物由50～60個氨基酸殘基組成的多肽，根據(jù)SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳（SDS－PAGE）測定結(jié)果，分子量主要在 6 000～7 000之間者符合本實驗要求。收集PESV蛋白峰，臨用時PESV用生理鹽水溶解稀釋成各濃度。

1.3 主要試劑及儀器 RPIM－1640（Gibco公司），青霉素、鏈霉素（Hyclone公司），環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（蘭州民海生物公司），Transwell板（Corning公司），Matrigel凝膠（BD公司），抗腫瘤壞死因子（TNF－α），（Peprotech公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），錐蟲藍（Amresco公司）。

2 方法

2.1 繪制生長曲線 錐蟲藍染色，選取活細胞數(shù)>95%的病例。調(diào)整待用細胞懸液細胞數(shù)至5×105個/mL，接種于24孔板，每天用錐蟲藍染色計活細胞數(shù)，連續(xù)7 d，繪制生長曲線。

2.2 錐蟲藍實驗 選取對數(shù)生長期的細胞懸液，調(diào)整濃度至5×105個/mL，180μL接種于96孔板，分為藥物組和對照組分別加入PESV 1、10、100、1000μg/mL和生理鹽水各20μL，每個藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔，孵箱孵育24 h后錐蟲藍活細胞拒染法測活細胞數(shù)。細胞生長抑制率＝（空白孔平均值－加藥組平均值）/空白孔平均值×100%。實驗重復(fù)5次。

2.3 LSC在模擬骨髓壁龕中遷移實驗 將8μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜上均勻涂一層人工基底膜，5μg/10μL，使之干燥，形成一個基質(zhì)屏障層。將白血病細胞PBS洗滌后，懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，終濃度為2×105個/mL。將細胞懸液加到Transwell小室中，每小室加100μL。24孔板分為實驗組和對照組各加入蝎毒多肽提取物和等量生理鹽水，將小室浸泡于24孔培養(yǎng)板的條件培養(yǎng)基中。37 ℃，5%CO2培養(yǎng) 18 h，取出 Transwell，濾膜用甲醇固定，蘇木精-伊紅染色，水洗，將膜封于載玻片上，于高倍鏡下計數(shù)遷移細胞數(shù)，每膜計數(shù)上、中、下、左、右5個不同位點的透過細胞數(shù)，計算平均值。

2.4 統(tǒng)計方法 采用線性相關(guān)分析法選擇24 h藥物作用濃度，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LSC分離培養(yǎng) 見圖1。

3.2 LSC生長曲線 白血病干細胞在體外培養(yǎng)24 h后進入對數(shù)生長期，96 h后進入生長平臺期，見圖2。

3.3 PESV（蝎毒多肽）對LSC在模擬骨髓龕中遷移能力的影響 PESV低、中、高濃度均有抑制LSC穿過人工基底膜的能力，其阻抑遷移率分別為（25.01±6.83）%、（36.85±3.83）%、（50.73±7.15）%。對照組環(huán)磷酰胺（CTX）的阻抑遷移率（49.10±6.12）%。PESV組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量與中、高劑量組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量PESV與低、高劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組抑制遷移率明顯較高。見表1。倒置顯微鏡下，高劑量組可見侵襲小室下室內(nèi)細胞數(shù)量減少，分布散亂不均，而對照組下室內(nèi)細胞數(shù)量較多，多成簇分布。

表1 PESV抑制LSC透過人工基底膜遷移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

表1 PESV抑制LSC透過人工基底膜遷移率（±s）Tab.1 The transport ratiosof PESV inhibiting LSCs from permeating artificialbasementmembrane（±s）%

注：與 PESV 組比較，*P<0.05；與中、低劑量組比較，▲P<0.05。

組別 濃度 遷移率實驗組 PESV低劑量 25.01±6.83 PESV中劑量 36.85±3.83 PESV 高劑量 50.73±7.15▲對照組 CTX 49.10±6.12*

4 討論

目前治愈白血病的關(guān)鍵之一是清除患者體內(nèi)LSC，抑制白血病的復(fù)發(fā)，不僅僅是如何獲得骨髓形態(tài)學(xué)緩解、免疫學(xué)緩解、遺傳學(xué)緩解。LSC靜止于骨髓壁龕內(nèi)，通常處于G0期，并不進入細胞周期，當(dāng)骨髓壁龕微環(huán)境發(fā)生變化時，LSC才會進入細胞周期，開始增殖分化。所以常規(guī)化療藥物對LSC無能為力；分子靶向藥物雖然可以識別它，但不能傷害或清除LSC；同樣干細胞移植也不能清除患者體內(nèi)的LSC。因此，調(diào)控LSC長期保持G0期狀態(tài)就尤為關(guān)鍵，只有這樣才能使控制白血病復(fù)發(fā)或進展成為可能。

干細胞壁龕的假說是在20世紀(jì)70年代針對造血干細胞（HSCs）的特殊微環(huán)境而提出來的[1]?，F(xiàn)已在多種生物的不同組織中明確了相應(yīng)干細胞的壁龕細胞，如果蠅卵巢中的帽子細胞、末端絲狀細胞和內(nèi)發(fā)生鞘細胞，哺乳動物骨髓中的成骨細胞等[2]。干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有自我更新和高度增殖能力，并可以分化成機體內(nèi)至少一種成熟細胞。干細胞有多種重要的特征，如自我更新和分化潛能、對稱及非對稱性的分裂方式、處于有絲分裂G0期、具有分化為所寄居組織細胞和跨譜系分化的能力等。干細胞的生物學(xué)特性一方面是自身預(yù)先程序化的結(jié)果；另一方面受其所處微環(huán)境的影響[3]。干細胞特征的維持與干細胞所處的壁龕微環(huán)境有密切關(guān)系。干細胞壁龕可通過與干細胞之間的直接和（或）間接作用，發(fā)揮多重生物學(xué)功效—錨定干細胞并調(diào)控其處于G0期。正常情況下，干細胞寄居在組織或器官特定的壁龕中，這與干細胞和壁龕成分之間表達的黏附分子有關(guān)。鈣黏蛋白和整合素介導(dǎo)的細胞黏附是普遍存在的壁龕錨定干細胞的機制[4]。在果蠅卵巢中，生殖干細胞（GSCs）與帽子細胞、體干細胞與內(nèi)生發(fā)鞘細胞之間都存在DE-cadherin，該基因突變可以引起干細胞的丟失；在骨髓造血微環(huán)境中，HSCs能定居于以成骨細胞為主的壁龕中就與N-cadherin有關(guān)[5]。干細胞表面的整合素可以介導(dǎo)干細胞與ECM之間的黏附，從而使干細胞定居于壁龕中。表皮干細胞一個顯著的特點是與基底膜的黏附，這種黏附也是通過整合素實現(xiàn)的。b1-integrin可以作為特異性較高的表皮干細胞表面標(biāo)志物。干細胞壁龕可以錨定干細胞的另一個證據(jù)是它可以招募新的干細胞，即干細胞的“歸巢”。對經(jīng)照射宿主的骨髓移植HSCs后觀察，發(fā)現(xiàn)移植的HSCs在細胞因子的趨化作用下最終進入宿主骨髓的HSCs壁龕中[6]。同時，干細胞壁龕還為干細胞提供了一個控制增殖、抑制分化的微環(huán)境。

現(xiàn)在臨床應(yīng)用的全蝎多屬東亞鉗科，全蝎主要有效成分是蝎毒多肽提取物PESV，它由多種含有20～80個氨基酸、分子量3 000～10 000蛋白組成，大多數(shù)有3～4對二硫鍵交聯(lián)而成。PESV作為多種蝎毒抗癌組分中一種，受到越來越多學(xué)者的重視。有學(xué)者證實PESV至少通過抑制Bcl-2及促進Bax蛋白表達來誘導(dǎo)癌細胞凋亡的[7]；同時還在實驗中發(fā)現(xiàn)PESV對數(shù)種腫瘤細胞具有毒性作用，可使進入S期的癌細胞明顯減少，G1、S和G2期細胞的百分比增多，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[8]。

雖然本研究從體外實驗證實PESV對白血病細胞黏附力及侵襲力的有抑制作用，并呈劑量依賴性，但白血病髓外浸潤的發(fā)生是多因素、多環(huán)節(jié)、多步驟相互影響，相互作用的結(jié)果[9]。本課題組將進一步從分子生物學(xué)角度探討PESV阻抑白血病髓外浸潤的分子機制。

[1]Lapidot T,Sirard C,Vormoor J,etal.A cell initiating human acute myeloid leukemiaaftertransplantation intoSCIDmice[J].Nature,1994,367(6464):645-648.

[2]Bonnet D,Dick JE.Human acutemyeloid leukemia is organized as ahierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].NatMed,1997,3(7):730-737.

[3]Passegue E,Jamieson Ch,Ailles LE,et al.Normal and leukemichematopoiesis:are leukemiasa stem cell disorder or a reacquisitionofstem cellcharacteristics?[J].ProcNatlAcad SciUSA,2003,100(11):11842-11849.

[4]Gilliland DG,Jordan CT,FelixCA.Themolecularbasisof leukemia[J].Hematology,2004(1):80-97.

[5]Hope KJ,J in L,Dick JE.Acutemyeloid leukemia originates from ahierarchy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity[J].Nat Immunol,2004,5(7):738-743.

[6]CozzioA,PassegueE,AytonPM,etal.SimilarMLL-associated leukemiasarising from self-renewing stem cellsand short-livedmyeloid progenitors[J].GenesDev,2003,17(24):3029-3035.

[7]張月英，張維東，賈 青.蝎毒多肽提取物誘導(dǎo)前列腺癌DU-145細胞凋亡的實驗研究[J].實用癌癥雜志，2006，21（3）：225－231.

[8]孔天翰，林 山，韓雪飛.蝎毒多肽對腫瘤細胞的抑制作用研究[J].中國病理生理雜志，2004，20（6）：968－972.

[9]楊文華，楊向東，史哲新，等.蝎毒多肽干預(yù)白血病細胞浸潤效應(yīng)及分子機制[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（1）：15.

Experiment research on PESV for inhibiting activation of leucem ia stem cell in the niche

YANGXiang-dong,YANGWen-hua,SHIZhe-xin,etal
(DepartmentofHematology,The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China)

[Objective]To observe the effectof PESV(peptide extract from scorpion venom)for inhibiting the activation of leucemia stem cells(LSC)in the niche.[Methods]LSCwere isolated from patientswith AML/ALL and stored in the Transwell.Then theywere divided into four groups:high-dose group,middle-dose group,low-dose group and the positive control group.After cultured with different concentrations of PESV,the transport ratios of LSC in various concentration groups were computed at different time.[Results]The transportratiosculturedwith differentconcentrationsofPESVwere(25.01±6.83)%,(36.85±3.83)%,(50.73±7.15)%,and therewasasignificant difference compared with thatof the positive controlgroup(49.10±6.12)%(P<0.05).The transport ratio in the high-dose group ismore than that of the middle and lose-dose groups.[Conclusion]All different concentrations of PESV have the inhibiting effects against the activation of LSCwith a inhibiting intensity depending on the concentrationsof PESV.

PESV;LSC;niche;activating effect

R285.5

A

1672-1519(2011)04-0329-03

天津市教委計劃資助項目（OTJCYBJC1150）。

楊向東（1977-），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事血液病臨床與實驗研究工作。

2011-04-10）