崔曼莉， 王景杰， 王旭霞， 楊 琦， 黃裕新 (第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科， 西安 710038;通訊作者，E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

內(nèi)臟高敏感性是腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)的重要病理特征。有研究表明IBS患者對腸擴張性刺激的疼痛閾值明顯降低、疼痛強度增加，出現(xiàn)內(nèi)臟高敏感現(xiàn)象，或?qū)е抡Ｄc道功能狀態(tài)敏感性的顯著增高(即異常性疼痛)，甚至使內(nèi)臟相對應(yīng)的軀體牽涉痛的范圍擴大［1］。IBS患者內(nèi)臟的高敏感性具有放大效應(yīng)，這一過程被稱為致敏或刺激性痛覺過敏。有研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)的損傷可以產(chǎn)生放大的疼痛反應(yīng)，同時激活脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞，進一步采用NMDA拮抗劑MK801可以抑制產(chǎn)生的痛覺過敏和異常性疼痛，同時也抑制了神經(jīng)膠質(zhì)細胞［2］。上述研究提示，膠質(zhì)細胞在病理性痛的產(chǎn)生和維持中有重要作用。有研究證實，MAPK-p38廣泛存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。MAPK-p38在調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮著重要的作用［3］，而且對于活化和維持神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞狀態(tài)上也具有重要作用。

本實驗在以旋毛蟲感染大鼠成功制作IBS大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用直腸氣囊充水造成壓力感受刺激的方法，研究給予模型大鼠結(jié)腸擴張刺激和椎管內(nèi)插管注射MAPK-p38特異性阻斷劑SB203580，觀察其腹直肌肌電、脊髓背角中MAPK-p38、ERK表達的變化，為研究IBS內(nèi)臟敏化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 IBS動物模型制作 ①毛蟲幼蟲制備及傳代由河南省CDC提供的保蟲昆明鼠種鼠(旋毛蟲系云黑龍江株)3只，脊髓脫臼法處死后剔除皮毛及內(nèi)臟，剔取肌肉。將肌肉剪碎置于300 ml 2.5%胃蛋白酶和0.5%鹽酸消化液中，置37℃水浴中消化12－20 h。經(jīng)篩過濾，濾液用生理鹽水反復(fù)沉淀洗滌3－5次，收集旋毛蟲幼蟲胞囊并計數(shù)。取昆明鼠20只，25 g左右，灌胃法給予0.1 ml含250－300條幼蟲的生理鹽水懸液。②感染大鼠后將傳代感染的昆明鼠以頸椎脫臼法處死收集旋毛蟲(方法同前)。③實驗組大鼠灌胃法給予1 ml含4 000條幼蟲囊胞的生理鹽水懸液。被感染鼠飼養(yǎng)8周，抽檢測定感染情況，確立模型成功制作［4］。

1.2 實驗分組 15只IBS大鼠隨機分為3組:IBS組(C組，n=5)、IBS結(jié)腸擴張刺激組(D組，n=5)、抑制劑組(E組，n=5);另10只正常大鼠隨機分為2組:正常對照組(A組，n=5)、正常結(jié)腸擴張刺激組(B 組，n=5)。

1.3 結(jié)腸擴張刺激 對結(jié)腸擴張刺激組、IBS刺激組、抑制劑組進行結(jié)腸擴張刺激。將氣囊緩慢插入大鼠直腸，進入到結(jié)腸距離肛門35 mm處固定，用注射器給氣囊注入 1.0 ml蒸餾水［5］。

1.4 椎管內(nèi)置管給藥 對于IBS抑制劑組5只大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，按Yaksh等［6］方法鞘內(nèi)置入PE-10導(dǎo)管至脊髓腰膨大處，插入深度2.5－4.0 cm。鞘內(nèi)注射2%利多卡因20 μl，30 s內(nèi)出現(xiàn)雙下肢麻痹，表明導(dǎo)管位置準(zhǔn)確。大鼠置于安靜、溫暖、避光的環(huán)境中飼養(yǎng)5 d，取置管后3 d無運動功能障礙的大鼠，取標(biāo)本2 h前抑制劑組鞘內(nèi)注射 SB203580 10 μl(30 μg，溶媒為2%DMSO)，注藥后均用0.9%NaCl 10 μl沖洗導(dǎo)管［7］。其余各組只打開椎板，不損傷脊髓，插入導(dǎo)管后固定縫合，不給予任何處理。

1.5 切片制備 將兩組大鼠于戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉下，開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管，先以100 ml生理鹽水沖洗血液，隨后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)先快后慢灌流固定2 h，取骶髓置于300 g/L蔗糖中(4℃)直至組織沉底，冰切片機以做冷凍連續(xù)冠狀切片，片厚30 μm，切片分套，置于0.01 mol/L PBS中存放。

1.6 免疫熒光化學(xué)標(biāo)記 P38-OX42免疫熒光染色:取3套切片在0.01 mol/L PBS中漂洗后，入含0.3%Triton X-100 的 0.01 mol/L PBS 中浸泡 30 min(室溫)。然后分別入小鼠抗大鼠P38單克隆抗體稀釋液(1∶500，Sigma)、兔抗大鼠OX42單克隆抗體稀釋液(1∶500，Sigma)孵育24 h(室溫);加入結(jié)合了熒光素的二抗:驢抗小鼠FITC(1∶500，Molecular Probes)單染P38以及山羊抗兔DyLight熒光標(biāo)記OX42，避光孵育2 h(室溫)。0.01 mol/L PBS洗3次后，DAPI染色液染細胞核(美國 Molecular Probes)，80%甘油封片后，將各組切片各取10張，在confocal激光共聚焦顯微鏡下觀察并采圖，采用Image J 1.43圖像分析軟件，分析P38、ERK的熒光光度值。

ERK-OX42免疫熒光染色:染色步驟同上，一抗為小鼠抗大鼠ERK單克隆抗體稀釋液(1∶500，Sigma)、兔抗大鼠OX42單克隆抗體稀釋液(1∶500，Sigma)，二抗為 FITC標(biāo)記驢抗小鼠抗體(1∶500，Sigma)、山羊抗兔 DyLight熒光標(biāo)記二抗(1∶500，Molecular Probes)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件進行分析，以±s表示;熒光半定量經(jīng)ImageJ 1.43軟件進行處理，各組間差異采用ANOVA方差分析進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骶髓后角中 P38、ERK表達的變化 P38-OX42實驗結(jié)果顯示，在給予刺激后結(jié)腸擴張刺激組大鼠脊髓后角中P38、OX42表達水平升高(P＜0.05);IBS組大鼠 P38、OX42表達亦較高，且與正常對照組和結(jié)腸擴張刺激組比較差異明顯(P＜0.05);IBS擴張刺激組大鼠骶髓后角中P38、OX42表達處于較高水平，與正常對照組大鼠比較差異顯著(P ＜0.01，見表 1、圖 1，見第 693 頁)。抑制劑組在給予SB203580后P38表達明顯下降，同時OX42水平降低，且差異顯著(P＜0.01)，雖仍高于正常大鼠表達水平，但二者比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05，見表1、圖1，)。

骶髓后角ERK表達情況與P38類似，在給予刺激后，結(jié)腸擴張刺激組大鼠骶髓后角中ERK、OX42表達亦處于較高水平，與正常對照組大鼠比較差異顯著(P＜0.05);IBS組大鼠 ERK、OX42表達水平高于正常組和結(jié)腸擴張刺激組(P＜0.05);IBS擴張性刺激組大鼠骶髓后角中P38表達處于較高水平，與正常組大鼠比較差異顯著(P＜0.01)，抑制劑組大鼠在給予SB203580后ERK、OX42表達略下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1、圖2。

圖1 抑制劑SB203580對骶髓DCN中P38和OX42表達的影響Fig 1 Effect of inhibitor SB203580 on expression of P38，OX42 in sacral DCN

圖2 抑制劑SB203580對骶髓DCN中ERK和OX42表達的影響Fig 2 Effect of inhibitor SB203580 on expression of ERK，OX42 in sacral DCN

表1 骶髓DCN中P38、ERK表達熒光光度值(OD)變化(n=5，±s)Tab 1 OD value of P38，ERK expression in sacral DCN(n=5，±s)

表1 骶髓DCN中P38、ERK表達熒光光度值(OD)變化(n=5，±s)Tab 1 OD value of P38，ERK expression in sacral DCN(n=5，±s)

與正常對照組比較，*P＜0.05;與結(jié)腸擴張刺激組比較，#P ＜0.05;與 IBS擴張刺激組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別 P38 ERK OX42P38 OX42ERK 2.44 ±0.47 0.28 ±0.10 69.78 ±2.66 72.55 ±3.82結(jié)腸擴張刺激組 3.72 ±0.51* 0.38 ±0.12* 77.34 ±1.99* 81.22 ±3.86*IBS 組 4.68 ±0.52# 0.49 ±0.09# 86.48 ±3.21# 84.36 ±2.79#IBS 擴張刺激組 6.64 ±0.57 0.63 ±0.11 126.22 ±2.84 131.14 ±3.41抑制劑組 3.82 ±0.68△△ 0.40±0.09△ 80.75 ±1.77△△ 75.80 ±2.37正常對照組△△

2.2 各組腹直肌肌電變化 對各組大鼠進行腹直肌肌電檢測可見IBS組與正常對照組大鼠腹直肌肌電相似，頻率和波幅無明顯差異(P＞0.05);結(jié)腸擴張刺激組與IBS擴張刺激組肌電變化明顯，頻率及波幅明顯高于對照組(P＜0.05);然而給予抑制劑SB203580后，肌電頻率及波幅明顯趨于平穩(wěn)，與IBS結(jié)腸擴張刺激組比較差異明顯(P＜0.05)，與正常對照組和IBS組大鼠比較無明顯差異(P＞0.05)，見圖3，表2。

圖3 抑制劑SB203580對結(jié)腸擴張刺激引起的IBS大鼠腹直肌肌電影響Fig 3 Effect of inhibitor SB203580 on myoelectricity of rectus abdominis in IBS rats caused by stimulation of colorectal distention

表2 抑制劑SB203580對結(jié)腸擴張刺激引起的IBS大鼠腹直肌肌電頻率、波幅變化(n=5，±s)Tab 2 Effect of inhibitor SB203580 on myoelectricity frequency and amplitude of rectus abdominis in IBS rats caused by stimulation of colorectal distention(n=5，±s)

表2 抑制劑SB203580對結(jié)腸擴張刺激引起的IBS大鼠腹直肌肌電頻率、波幅變化(n=5，±s)Tab 2 Effect of inhibitor SB203580 on myoelectricity frequency and amplitude of rectus abdominis in IBS rats caused by stimulation of colorectal distention(n=5，±s)

與正常對照組比較，*P＜0.05;與IBS結(jié)腸擴張刺激組比較，#P ＜0.05

組別 頻率/(min－1) 波幅/μV 3.23 ±0.33 23.42 ±6.89結(jié)腸擴張刺激組 3.52 ±0.61* 50.20 ±8.77*IBS 組 3.55 ±0.19 24.88 ±8.35 IBS結(jié)腸擴張刺激 3.83 ±0.11* 76.34 ±10.71*抑制劑組 3.48 ±0.28# 26.74 ±7.67正常對照組#

3 討論

有絲分裂原激活蛋白激酶p38(mitongen-activated protein kinase，MAPK)是一組酶兼底物的蛋白分子，其中MAPK更具有廣泛的催化活性，MAPK在胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，主要包括:Ras/ERK，JNK/SAPK和MAPK-p38，分別通過三種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達［8］。以往的研究表明，在組織和神經(jīng)損傷后MAPK通過不同的細胞和分子生物學(xué)途徑促成疼痛敏化。MAPK-p38廣泛存在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，在調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的穩(wěn)態(tài)及對于活化和維持神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞狀態(tài)上也具有重要作用。活化的MAPK-p38可能通過多種機制參與IBS內(nèi)臟痛敏的形成和發(fā)展:傷害性刺激誘發(fā)的傷害性神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸和P物質(zhì)的釋放均能引起Ca2+內(nèi)流，引起細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促使p38MAPK激活和磷酸化［9］，p-p38MAPK 活化磷酯酶 A2(PLA2)，作用于細胞膜磷脂使花生四烯酸的表達明顯增加，花生四烯酸再通過環(huán)氧化酶(COX)的作用而生成前列腺素(PG)［10］。因此，p38作為特異的反應(yīng)在小膠質(zhì)細胞的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)節(jié)通路，其意義十分重要。

P38主要位于細胞質(zhì)中，其余MK5共表達并錨定掩蓋MK5的NSL，使得MK5轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中;而MK5的T182的磷酸化可以激活NES，使得MK5從胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中，但以前者為主。除了能被p38激活外，MK5還能被ERK3持續(xù)激活，P38通過與MK5結(jié)合將其錨定在胞質(zhì)中，MK5隨即以自主磷酸化或其他方式激活。有研究發(fā)現(xiàn)在MK5缺陷細胞中ERK3的水平顯著下降，而ERK3缺陷時MK5的活性也會下降，說明二者之間也可以形成類似于p38-MK2的穩(wěn)定復(fù)合體，來參與機體的調(diào)節(jié)。

本實驗室前期研究提示［11－13］，當(dāng)單純電針刺激足三里穴位時，調(diào)節(jié)胃腸運動的神經(jīng)中樞DCN中cfos的表達明顯增加，提示神經(jīng)元被激活，而且DCN中的GFAP和OX42的表達明顯增高，提示神經(jīng)膠質(zhì)細胞也被顯著激活。同時，同步觀察到胃電的波幅和頻率亦產(chǎn)生明顯變化。給予膠質(zhì)細胞代謝阻斷劑后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的活化功能也降低，說明神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元之間是相互影響的。而且同步記錄的胃電活動情況與正常對照組均有明顯的降低。由此得出，電針刺激足三里穴調(diào)節(jié)胃運動，不完全是神經(jīng)元活動的結(jié)果，膠質(zhì)細胞也參與了該調(diào)節(jié)運動。膠質(zhì)細胞的活化及其釋放的促炎癥釋放因子是痛覺過敏產(chǎn)生的基礎(chǔ)。

本實驗通過給予IBS大鼠MAPK抑制劑發(fā)現(xiàn)，脊髓DCN中P38、ERK表達明顯受到抑制，同時OX42表達水平亦明顯降低，說明小膠質(zhì)細胞活動也受到抑制，進一步證實在IBS內(nèi)臟高敏感情況下DCN中小膠質(zhì)細胞功能與P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)。電生理學(xué)角度亦表明給予抑制劑后大鼠腹肌電波幅、頻率均與IBS結(jié)腸擴張刺激組大鼠比較有明顯降低。由此分析，在脊髓層面上給予治療不但可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)疼痛神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，更可有效緩解IBS內(nèi)臟痛敏。為今后治療IBS內(nèi)臟高敏感的藥物探索和研發(fā)提供了新的靶點和途徑。

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