鄭壽煥，李金姬，張春子，楊秀麗，李美子

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉 133000)

CD36是一種多功能的清道夫受體，可激活細(xì)胞釋放前炎癥反應(yīng)性細(xì)胞因子、白介素等[1]，并參與脂質(zhì)代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。人 CD36基因定位于 7號(hào)染色體的 q11.2帶，該區(qū)域存在 2型糖尿病(T2DM)的易感位點(diǎn)。為探討 CD36內(nèi)含子 3[TG]多態(tài)性對(duì) T2DM患者血脂、C反應(yīng)蛋白(CRP)的影響，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2004年 12月 ～2009年 12月在我院住院的 T2DM患者(T2DM組)193例，男 106例、女 87例，年齡(54.0±12.1)歲。根據(jù)血脂水平分組，即總膽固醇(TC)＞6.45 mmol/L為 TC異常組，≤6.45 mmol/L為 TC正常組;TG＞1.88 mmol/L為 TG異常組，≤1.88 mmol/L為 TG正常組;HDL-C＜0.9 mmol/L為 HDL-C異常組，≥0.9 mmol/L為HDL-C正常組;LDL-C＞3.12 mmol/L為 LDL-C異常組，≤3.12 mmol/L為 LDL-C正常組。根據(jù) CRP分組，≤5.0 mg/L為 CRP正常組，＞5.0 mg/L為CRP異常組。同期隨機(jī)選擇在我院健康體檢者 80例作為對(duì)照組，臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查均正常，排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾病。男 38例、女 42例，年齡(45.7±17.9)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 CD36基因多態(tài)性檢測 ①基因組 DNA提取:抽取受檢者肘靜脈血 3 ml，用 Promega公司產(chǎn)Wizard 基因組 DNA純化試劑盒提取 DNA。所得DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，并置于 -70℃保存?zhèn)溆?。②PCR擴(kuò)增目的基因片段:根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院維護(hù)的基因序列數(shù)據(jù)庫中所報(bào)告的序列設(shè)計(jì)、北京華美公司合成的 CD36內(nèi)含子 3基因引物:上游引物:5′-ATTTATAAAAGAAGTTGCAC-3′，下游引物:5′-GTTTACCTACAATTTAATAA-3′;PCR循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 1 min，49℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，循環(huán) 35次，最后 72℃延伸 5 min。用 5%瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序:PCR產(chǎn)物用凝膠電泳 DNA回收試劑盒純化回收 DNA片段后，送北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司，完成 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序。

1.2.2 血脂、CRP檢測 抽取受檢者肘靜脈血 3 ml，采用日立 7600-101全自動(dòng)生化分析儀檢測 TC、TG、HDL、LDL、CRP水平 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列多態(tài)性各組間分布情況比較采用 χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組 CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列基因多態(tài)性分布比較 PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，兩組CD36內(nèi)含子 3全部為雜合子且存在[TG]重復(fù)序列，[TG]重復(fù)次數(shù)為 11～16次，如圖 1所示。據(jù)[TG]重復(fù)序列出現(xiàn)的頻數(shù)分為 11/＞11、12/＞12、＞12/＞12，各頻數(shù)在對(duì)照組中分別為 37.5%(30/80)、45.0%(36/80)、17.5%(14/80)，在 T2DM組中分別為 28.5%(55/193)、50.3%(97/193)、21.2%(41/193)，同頻數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序結(jié)果

2.2 CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列基因多態(tài)性對(duì)T2DM患者血脂、CRP的影響 見表1。

表1 CD 36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列基因多態(tài)性分布時(shí) T2DM患者血脂、CRP的影響[例(%)]

3 討論

CD36是巨噬細(xì)胞表面的一種 B類清道夫受體，廣泛存在于單核細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，參與炎癥、止血、免疫清除、脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化等病理生理過程[2]。Zhang等[3]研究指出，CD36表達(dá)增加可能是導(dǎo)致糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一，高糖介導(dǎo) CD36mRNA翻譯增加使巨噬細(xì)胞表面 CD36表達(dá)增高，為糖尿病時(shí)動(dòng)脈粥樣硬化加劇提供了基礎(chǔ)。

目前已明確，高 LDL-C和低 HDL-C對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成具有重要作用。T2DM患者脂質(zhì)代謝紊亂的三聯(lián)癥(即 TG升高、LDL升高、HDL降低)是心血管疾病的危險(xiǎn)因素[4]。高脂血癥可導(dǎo)致腎小球高濾過，加重糖尿病患者的腎臟損害[5]。LDL-C升高，可促進(jìn)動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞過度增生，加速動(dòng)脈粥樣硬化，增加腎小球毛細(xì)血管內(nèi)壓，導(dǎo)致腎小球高濾過。過高的 LDL-C滯留于內(nèi)皮下，經(jīng)細(xì)胞氧化修飾形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)。ox-LDL能增加氧自由基的產(chǎn)生，從而促進(jìn)腎小球內(nèi)過氧化物陰離子生成，加快糖尿病腎病進(jìn)展。另外，LDL-C尤其 ox-LDL具有化學(xué)趨化作用，被巨噬細(xì)胞攝取后刺激其產(chǎn)生生產(chǎn)因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化[6]。LDL-C水平增高，還可導(dǎo)致免疫復(fù)合物堆積，并黏附大量的巨噬細(xì)胞，兩者的復(fù)合物可釋放炎性介質(zhì)[7]。對(duì)糖尿病腎病患者而言，炎性狀態(tài)使 LDL易氧化為 ox-LDL，高水平的 ox-LDL具有細(xì)胞毒作用，可損害腎小球小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，造成白蛋白尿的進(jìn)一步增加[8]。Sampson等[9]證實(shí)，ox-LDL與 CD36表達(dá)存在相關(guān)性，體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境下細(xì)胞表面 CD36表達(dá)增高，同時(shí)伴有巨噬細(xì)胞攝取 ox-LDL增加。

CRP是機(jī)體受到損傷或發(fā)生各種急慢性炎癥后產(chǎn)生的一種敏感反應(yīng)蛋白，是臨床上最有效的炎癥標(biāo)志物之一。榮嶸等[10]研究表明，T2DM患者血清 CRP與糖尿病并發(fā)癥密切相關(guān)。CRP能直接作用于血管內(nèi)皮，并促進(jìn)早期動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生;CRP還參與血栓形成、白細(xì)胞黏附，促進(jìn)單核細(xì)胞的活化及轉(zhuǎn)化，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而加速和(或)加重 T2DM患者血管并發(fā)癥。Abrahamian等[11]研究顯示，糖尿病腎病患者增高的 CRP與增加的尿蛋白排泄有關(guān)，提示 CRP參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。國外研究表明[12]，CD36在前炎癥因子和氧化應(yīng)激介導(dǎo)的腎損傷中起關(guān)鍵性作用。ox-LDL通過 CD36和 PKC依賴途徑激活巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB。實(shí)際上 ox-LDL能觸發(fā)炎癥因子如TNF-α/β、IL-1β、IL-2、IL-6及 IFN-β/γ的分泌，而且有 ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞或泡沫細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制依賴于 CD36和半胱天冬氨酸酶-3的激活。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，許多前炎癥因子及抗炎癥因子被表達(dá)，這些炎癥因子可調(diào)節(jié) CD36的表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組與 T2DM組 CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列基因多態(tài)性分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而 T2DM各組間 HDL-C組、LDL-C組及CRP組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD36內(nèi)含子 3[TG]＞12/＞12重復(fù)序列在 HDL-C異常組占36.2%，在 HDL-C正常組占 16.4%(P＜0.05);LDL-C異常組占 40.6%，在 LDL-C正常組占 17.4%(P＜0.05);在 CRP異常組占 34.1%，在 CRP正常組占16.7%(P＜0.05)。說明 CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列基因多態(tài)性與 T2DM患者的 HDL-C、LDL-C、CRP水平有關(guān)。CD36內(nèi)含子 3[TG]＞12/＞12重復(fù)序列可能是 T2DM患者的 HDL-C水平降低、LDL-C和 CRP水平升高的遺傳因素。

綜上所述，我們認(rèn)為 CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)序列基因多態(tài)性與 T2DM患者 HDL-C、LDL-C、CRP水平有關(guān)。但 CD36內(nèi)含子 3[TG]重復(fù)次數(shù)對(duì) CD36的表達(dá)、血脂及 CRP的影響途徑和機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。

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