李爭明，劉 紅*，黃庶識，榮 曦，鄺曉聰

(1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021;2廣西科學院;3廣西醫(yī)科大學)

拉曼光譜技術是一種新的研究凋亡細胞內物質結構和含量變化的有效手段。近年利用其分析研究人肺癌 A549細胞及胃癌細胞的凋亡已有報道[1]，但對胰島β細胞凋亡的研究鮮見報道。2010年4～9月，我們觀察了隨著細胞凋亡率的增加拉曼光譜的變化情況，并探討了拉曼光譜在正常與高糖誘導后凋亡的 NIT-1細胞的差別?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及分組 將 NIT-1細胞(β細胞株NIT-1細胞來源于 NOD小鼠，由廣西醫(yī)科大學夏寧教授惠贈)培養(yǎng)于含 15%胎牛血清、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的葡萄糖濃度為 11.1 mmol/L RPMI 1640培養(yǎng)基中，細胞在相對濕度為95%、37℃、5%CO2的環(huán)境中單層生長，每隔 2～3 d換液;4～5 d傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。根據不同葡萄糖濃度及不同培養(yǎng)時間對 NIT-1細胞分組，處理前細胞即對數生長期細胞為 NG0;對數生長期細胞消化、計數，以 1×105/ml密度接種，培養(yǎng) 24 h后分為:NG1(正常濃度葡萄糖培養(yǎng)第 2天)、NG2(正常濃度葡萄糖培養(yǎng)第 4天)、HG1(高糖培養(yǎng)第 2天)、HG2(高糖培養(yǎng)第 4天)、HG3(高糖培養(yǎng)第 4天漂浮在培養(yǎng)基中的細胞)。每組重復 6個樣本。

1.2 流式細胞儀檢測凋亡 收集按上述分組處理的各組細胞，細胞染色及流式細胞儀測定細胞的凋亡率，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。(Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 細胞拉曼光譜的測定 為了獲得單個細胞的整體光譜，采用激光點動態(tài)掃描模式，激光點在一個周期內分別向 X軸橫向和 Y軸縱向運動，掃描頻率被設定為 1 Hz，以 20 mW激發(fā)功率和 30 s曝光時間進行光譜采集。從各組細胞中隨機選取一部分用于拉曼光譜的檢測。檢測流程:加樣，隨機選取視野，視野中每個細胞均檢測，PI染色法區(qū)分死亡細胞并舍棄，重復以上操作直到獲得 50個非死亡細胞的數據。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，多組間均數比較采用方差分析，并用SNK法做兩兩比較。光譜數據經過背景扣除、平滑、基線校正、歸一化、峰面積計算(峰面積:峰最高點的前 4個與后4個拉曼位移的強度之和)等處理，以光譜峰面積作為計量資料，數據呈非正態(tài)分布，以中位數表示，多組間差異比較采用 Kruskal-Wallis法進行非參數檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率的比較 見表1。

表1 各組 NIT-1細胞凋亡率的比較(%，±s)

表1 各組 NIT-1細胞凋亡率的比較(%，±s)

注:HG1與 NG1、HG2與 NG2比較，*P＜0.01;與 NG0組比較，△P＜0.01;與 HG1組比較，﹟ P＜0.01;與 HG2比較，▼ P＜0.01

組別 n 細胞凋亡率NG0 6 6.09±0.48 NG1 6 10.70±0.99△NG2 6 12.96±4.62△HG1 6 21.26±0.63△*HG2 6 35.21±4.80△*﹟HG3 6 98.22±1.95△﹟▼

2.2 細胞拉曼光譜的變化情況 比較 714/cm、781/cm、1 001/cm、1 086/cm、1 337/cm、1 447/cm、1 655/cm各峰的峰面積后發(fā)現(xiàn)，隨著高糖培養(yǎng)時間的延長、細胞凋亡率的增加 1 001/cm峰(指認苯丙氨酸[2])和 1 337/cm峰(指認腺嘌呤[2])峰面積呈降低的趨勢(P＜0.05)。見圖1、2。

圖1 各組隨著凋亡率的增加平均光譜變化情況

圖2 各組 1 001/cm與 1 337/cm峰峰面積比較

3 討論

拉曼光譜信息從入射光與樣品分子對入射光振動頻率的差別中得到，光譜的振動頻率是原子團和化學鍵的特性[2]，因此分析拉曼光譜可以獲得相應原子團與化學鍵的構象及含量的相關信息，現(xiàn)已成為物理、生物醫(yī)學等跨學科領域研究和檢測的重要方法[3，4]。拉曼譜線強度正比于散射中心的數目，亦即光譜峰面積的大小正比于其指認物質含量的多少[5，6]。1 001/cm與 1 337/cm峰峰面積分別代表蛋白質及核苷酸的含量[2]。本研究 1 001/cm與1 337/cm峰峰面積總體上隨著凋亡率的增加而降低，表明細胞內蛋白質及 DNA的含量隨著凋亡率的增加而不斷降低，與 Notingher等[1]研究一致，也與目前對凋亡的認識是一致的。

細胞發(fā)生凋亡時半胱氨酸蛋白酶家族的成員被水解激活，活化的酶又可以催化其他底物蛋白的水解，凋亡細胞膜通透性增高，細胞內蛋白質可以從細胞膜漏出，造成細胞內蛋白質含量的降低。細胞凋亡時，內源性的核酸內切酶被激活，在核小體的連接處將 DNA切斷為 200 bp整數倍的小片段，凋亡晚期 DNA降解加劇，并且細胞膜通透性更高，降解的核酸就通過細胞膜擴散到細胞外，因此核酸堿基的含量也會下降。至于具體哪些蛋白質、DNA發(fā)生上述變化，還需要借助其他分子生物學手段進一步分析確認。高糖誘導 β細胞凋亡，促凋亡蛋白如 Bax、Bim、Puma、TXNIP、p53等表達會增加[7，8]，同時凋亡的細胞因為蛋白質的水解使蛋白質含量下降;高糖還可以刺激 β細胞分泌胰島素。凋亡細胞內除有DNA降解斷裂外還有促凋亡蛋白基因合成，同時高糖刺激胰島素合成分泌，胰島素基因的合成也會增加。高糖培養(yǎng)第 2天與相應的正常對照組及處理前組 1 001/cm峰峰面積無統(tǒng)計學差異，高糖培養(yǎng)第 2天與相應的對照組 1 337/cm峰峰面積也無統(tǒng)計學差異，但凋亡率卻有統(tǒng)計學差異。本研究測定的樣本包括正常與凋亡細胞，考慮由上述原因造成蛋白質及 DNA減少與增加的量相平衡時差別就不能顯現(xiàn)出來。處理前與正常糖濃度培養(yǎng)第 2天及第 4天的凋亡率差異并不大，但 1 337/cm峰面積有差異，考慮與對數生長期細胞內 DNA的含量較其他生長階段多及拉曼光譜靈敏度高有關。本研究高糖除可以誘導胰島 β細胞凋亡外，短期的高糖還會刺激其分泌胰島素，使得光譜的變化復雜化，若想觀察凋亡β細胞光譜動態(tài)的變化，也許使用對細胞僅有致凋亡作用的藥物來研究或對同一細胞從凋亡開始到凋亡結束整個過程進行實時檢測會好一些。

三磷酸腺苷(ATP)由腺嘌呤和三個磷酸分子組成，Szkudelshi等[9]認為鏈脲佐菌素是通過耗竭細胞內 ATP，使大量反應性氧簇產生從而對 β細胞產生損傷作用。梁燕玲等[10]發(fā)現(xiàn)凋亡細胞內 ATP的含量較正常細胞低，且凋亡率越高其含量越低。Faradji等[11]發(fā)現(xiàn)重組腺病毒轉染后高表達 GLUT2/GK的 β細胞凋亡率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，同時伴隨著 ATP的減少。本研究代表細胞內腺嘌呤含量的 1 337/cm峰峰面積隨著凋亡率的增加而降低，推測高糖有可能通過干擾細胞內的腺嘌呤核苷酸代謝而誘導細胞凋亡。腺嘌呤參與 ATP的組成，那么改善胰島 β細胞能量代謝，細胞的凋亡能否得到改善有待進一步研究。

綜上所述，激光光鑷拉曼光譜系統(tǒng)能反映凋亡細胞內蛋白質與核苷酸含量的變化，高糖有可能通過干擾細胞內腺嘌呤核苷酸代謝來誘導細胞凋亡，實驗中拉曼光譜的變化具體由何種蛋白質或核苷酸所貢獻，仍需要進一步研究。拉曼光譜能提供生物細胞內物質變化的豐富信息，有可能成為一種新的研究凋亡細胞內物質結構和含量改變的有效手段。

[1]Notingher I，Verrier S，Haque S，et al.Spectroscopic study of human lung epithelial cells(A549)in culture:living cellsversus dead cells[J].Biopolymers，2003，72(4):230-240.

[2]許以明.激光拉曼光譜儀[M].北京:科學出版社，1987:69-85.

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