朱 穎， 夏少秋， 趙 越

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院廣東廣州 510006)

果蠅衰老的進(jìn)程中會(huì)出現(xiàn)觸角、足以及部分翅膀的損傷，而這些損傷會(huì)造成血淋巴的丟失，血淋巴含有水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)可能對(duì)果蠅生存有很重要的作用［1］。本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)方法，人為地對(duì)果蠅的中足造成損傷，這有可能使這些殘疾的果蠅比正常的果蠅弱勢(shì)，甚至有可能使果蠅提前進(jìn)入衰老狀態(tài)。再用六味地黃生物制劑喂飼這些損傷的果蠅，考察其能否延緩衰老。

六味地黃湯(Liuwei Dihuang Decoction，簡(jiǎn)稱LW)是滋陰補(bǔ)腎、固本養(yǎng)生的經(jīng)典之方，歷經(jīng)千年而不衰。LW主要用于治療肝腎陰虛、腰膝酸軟、頭暈?zāi)垦?、耳鳴耳聾、遺精、消渴等腎陰不足之證［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明［3］，該方在調(diào)節(jié)免疫、抗衰老方面有很好的作用，并對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)有明顯的影響，臨床用于更年期綜合癥［4］，同時(shí)臨床上也用于治療骨折遲緩愈合［5］。六味地黃生物制劑(LW－PSB)是利用光合細(xì)菌代謝六味地黃湯，通過光合細(xì)菌的生物轉(zhuǎn)化功能和自身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的利用，制備出的現(xiàn)代制劑。它是一種經(jīng)過微生物發(fā)酵而形成的含有光合細(xì)菌菌體蛋白及其代謝分泌物、培養(yǎng)基和中草藥發(fā)酵物的混合物，不但比傳統(tǒng)的六味地黃湯有更強(qiáng)抗衰老作用［6］，而且營(yíng)養(yǎng)也更豐富。

1 方法和材料

1.1 器材與試劑

白砂糖、瓊脂、玉米粉、酵母粉(均為食品級(jí));恒溫生化培養(yǎng)箱BOXUN SPX－250B－Z型(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)等。

1.2 六味地黃生物制劑的制備

熟地黃，批號(hào) 060125;山茱萸(制)，批號(hào)060112;山藥，批號(hào)051228;牡丹皮，批號(hào)051206;茯苓，批號(hào)051219;澤瀉，批號(hào)051209。藥材均購(gòu)自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣東藥學(xué)院藥用植物學(xué)與中藥鑒定學(xué)教研室鑒定，均符合藥典規(guī)定。熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓按處方的比例(8∶4∶4∶3∶3∶3)配藥。加8倍量的水，經(jīng)自然發(fā)酵3個(gè)月后，濃縮至0.5 g/mL，再按一定比例加入光合細(xì)菌代謝6個(gè)月即得。

1.3 培養(yǎng)基的制備

1.3.1 普通培養(yǎng)基制備:水180 mL，白糖13 g，瓊脂1.3 g，玉米粉17 g，酵母粉1.4 g，丙酸1 mL。

1.3.2 含藥培養(yǎng)基制備:分別取 LW－PSB 0.1 g，0.2 g加入到100 g普通培養(yǎng)基中，得到質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%的含藥培養(yǎng)基。

1.4 動(dòng)物

美國(guó)野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)，購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院。溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度為(30±5)% 環(huán)境，12 h光照，12 h黑暗交替培養(yǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 交配實(shí)驗(yàn) 收集8 h內(nèi)新羽化雌雄黑腹果蠅成蟲，低溫麻醉，做如下處理［1］:Ⅰ剪去雌性果蠅兩側(cè)中足足尖;Ⅱ剪去雄性果蠅兩側(cè)中足足尖;Ⅲ剪去雌性果蠅一側(cè)整個(gè)中足;Ⅳ剪去雄性果蠅一側(cè)整個(gè)中足;Ⅴ正常的雌性果蠅;Ⅵ正常的雄性果蠅。每組10只果蠅，普通培養(yǎng)基飼養(yǎng)20 d。于第21天讓雌雄交配，交配方法:(1)為Ⅰ和Ⅱ交配;(2)為Ⅲ和Ⅳ交配;(3)為Ⅴ和Ⅵ交配。從合并開始計(jì)時(shí)，記錄11 min內(nèi)、22 min內(nèi)、33 min內(nèi)、44 min內(nèi)交配的總數(shù)。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次。

1.5.2 耐寒實(shí)驗(yàn) 收集8 h內(nèi)新羽化雌雄黑腹果蠅成蟲，低溫麻醉，做如下處理:Ⅰ剪去雌雄果蠅兩側(cè)中足足尖;Ⅱ剪去雌雄果蠅一側(cè)整個(gè)中足;Ⅲ不做任何處理。每組100只果蠅，雌雄各半。普通培養(yǎng)基飼養(yǎng)10 d。于第11天移入空的三角瓶中，置于－5℃環(huán)境中4.5 h，再與室溫下(14℃)復(fù)活6 h，觀察果蠅存活只數(shù)。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次。

1.5.3 攀爬實(shí)驗(yàn) 收集8 h內(nèi)新羽化雌雄果蠅成蟲，低溫麻醉，果蠅處理方法同1.5.2項(xiàng)。每組100只果蠅，雌雄各半。普通培養(yǎng)基飼養(yǎng)30 d。于第30天移入空的三角瓶中，再在其上覆蓋一個(gè)空的三角瓶，觀察30 min內(nèi)攀爬上覆蓋瓶中的果蠅只數(shù)。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)10次。

1.5.4 壽命實(shí)驗(yàn) 收集8 h內(nèi)新羽化黑腹雄性果蠅成蟲，低溫麻醉，做如下處理:Ⅰ剪去雌雄果蠅兩側(cè)中足足尖;Ⅱ剪去雌雄果蠅一側(cè)整個(gè)中足。每2天更換新鮮培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)開始后，每天定點(diǎn)觀察，記錄果蠅死亡數(shù)，直到各組果蠅全部死亡為止。前一半死亡的果蠅的壽命的算術(shù)平均數(shù)為半數(shù)死亡時(shí)間，全部果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為平均壽命，最后10只果蠅壽命的算術(shù)平均數(shù)為最高壽命，平均延壽率(%)=(給藥組平均壽命－空白對(duì)照組平均壽命)/空白對(duì)照組平均壽命×100%。統(tǒng)計(jì)各組果蠅半數(shù)死亡時(shí)間，平均壽命，最高壽命和平均延壽率。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 交配實(shí)驗(yàn)

從表1可知，前11 min，組Ⅰ與組Ⅲ比較，組Ⅰ的交配能力明顯弱于組Ⅲ(P＜0.05);從22 min到44 min，組Ⅰ，組Ⅱ的交配能力均比組Ⅲ能力弱，且差異有顯著性意義(P＜0.05，P＜0.01)。這可能與果蠅腿損傷后，行動(dòng)不便有關(guān)，還有與果蠅的交配方式有關(guān)。

2.2 耐寒實(shí)驗(yàn)

從表2可知，組Ⅰ雌雄果蠅存活數(shù)量均少于組Ⅲ，且差異有顯著性意義(P＜0.01)，平均存活率只有14.8%和15.2%。組Ⅱ雌雄果蠅存活數(shù)量也均少于組Ⅲ，均有顯著性差異(P＜0.01)，平均存活率只有15.6%和14.6%。而組Ⅰ和組Ⅱ沒有顯著性差異，其存活率均沒有達(dá)到組Ⅲ的一半。說(shuō)明損傷果蠅抵御低溫的能力比正常的果蠅的低，可能是損傷引起內(nèi)分泌失調(diào)，導(dǎo)致果蠅的耐寒能力下降。

表1 損傷對(duì)果蠅交配行為的影響(±s)Tab.1 Effect of injury on coputatory bebavior in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

表1 損傷對(duì)果蠅交配行為的影響(±s)Tab.1 Effect of injury on coputatory bebavior in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

與GroupⅢ比較，*P ＜0.05;與 GroupⅢ比較，**P ＜0.01，與GroupⅢ比較，***P ＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅢ;**P＜0.01 vs GroupⅢ;***P＜0.001 vs GroupⅢ.

組別 交配對(duì)數(shù)/對(duì)11 min 22 min 33 min 44 minⅠ 0.71±0.49* 1.29±1.11**1.86±1.21**2.43±1.40*1.71±0.95 2.86±0.69 3.86±1.07 4.14±0.90Ⅱ 1.00±0.82 1.71±0.76* 2.00±1.00**2.71±1.11*Ⅲ

表2 損傷對(duì)果蠅耐寒能力的影響(±s)Tab.2 Effect of injury on cold－resistant competence in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

表2 損傷對(duì)果蠅耐寒能力的影響(±s)Tab.2 Effect of injury on cold－resistant competence in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

與GroupⅢ比較，*P＜0.05;與 GroupⅢ比較，**P＜0.01;與GroupⅢ比較，***P ＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅢ;**P＜0.01vs GroupⅢ;***P＜0.001vs GroupⅢ。

組別 存活數(shù)/只 平均存活率/%♀♂♀♂Ⅰ 7.20±6.81**7.60±6.99**14.8 15.2Ⅱ 7.30±6.37**7.60±6.55** 15.6 14.6Ⅲ18.20±9.53 19.20±9.24 34.0 38.6

2.3 攀爬實(shí)驗(yàn)

從表3可知，組Ⅰ，組Ⅱ與組Ⅲ比較均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，說(shuō)明損傷能減弱果蠅的攀爬能力。

表3 損傷對(duì)果蠅攀爬能力的影響(±s)Tab.3 Effect of injury on climbing capability in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

表3 損傷對(duì)果蠅攀爬能力的影響(±s)Tab.3 Effect of injury on climbing capability in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

與GroupⅢ比較，*P＜0.05;與 GroupⅢ比較，**P＜0.01;與GroupⅢ比較，***P ＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅢ;**P＜0.01 vs GroupⅢ;***P＜0.001vs GroupⅢ。

組別 攀爬數(shù)/只 平均攀爬率/%♀♂♀♂Ⅰ 10.83±5.11**13.83±4.45***21.7 27.7Ⅱ 13.33±3.88* 13.00±4.69*** 26.7 19.3Ⅲ22.00±7.95 29.33±7.58 44.0 58.7

2.4 壽命實(shí)驗(yàn)

由表4可知，組Ⅰ中，雌性果蠅經(jīng)口喂飼質(zhì)量濃度0.1%、0.2%LW－PSB后，其半數(shù)死亡時(shí)間，平均壽命，最高壽命均高于喂飼普通培養(yǎng)基雌性果蠅(P＜0.001)，其平均延壽率分別達(dá)到29.7%、40.7%。雄性果蠅喂飼質(zhì)量濃度0.2%LW－PSB后，其數(shù)死亡時(shí)間，平均壽命，最高壽命均高于喂飼普通培養(yǎng)基雄性果蠅(P＜0.01，P＜0.001)，其平均延壽率為44.8%，而0.1%濃度僅能提高半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命(P＜0.05，P＜0.001)，對(duì)平均壽命沒有顯著影響。

組Ⅱ中，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1%時(shí)，雌性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間，平均壽命，最高壽命均高于空白對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.001);而雄性果蠅的僅半數(shù)死亡時(shí)間高于空白對(duì)照組(P＜0.001)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2%時(shí)，雌性果蠅的平均壽命和最高壽命均高于空白對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.001);雄性果蠅半數(shù)死亡時(shí)間和平均壽命均高于空白對(duì)照組(P＜0.001)。另外，隨著LW－PSB濃度的增加，抗衰老的效果也有增加的趨勢(shì)。

表4 六味地黃生物制劑對(duì)殘疾果蠅壽命的影響(±s)Tab.4 Effect of LW-PSB on life-span in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

表4 六味地黃生物制劑對(duì)殘疾果蠅壽命的影響(±s)Tab.4 Effect of LW-PSB on life-span in Drosophila melanogaster(ˉx ± s)

與GroupⅠ中空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與GroupⅠ中空白對(duì)照組比較，**P＜0.01;與 GroupⅠ中空白對(duì)照組比較，***P＜0.001。與GroupⅡ中空白對(duì)照組比較，#P＜0.05;與 GroupⅡ中空白對(duì)照組比較，##P＜0.01;與 GroupⅡ中空白對(duì)照組比較，###P＜0.001。*P＜0.05 vs GroupⅠcontrol group;**P＜0.01 vs GroupⅠcontrol group;***P＜0.001 vs GroupⅠcontrol group;#P＜0.05 vs GroupⅡcontrol group;##P＜0.01 vs GroupⅡcontrol group;###P ＜0.001 vs GroupⅡcontrol group。

組別 LW－PSB質(zhì)量濃度/% 性別 數(shù)量/只 半數(shù)死亡時(shí)間/d 平均壽命/d 最高壽命/d 平均延壽率/%Ⅰ59.90±1.07 24.2 100 19.30±3.64 27.88±10.34 47.30±3.27♂ 100 17.21±4.73 33.95±17.29 50.30±3.40 0.1 ♀ 100 24.70 ±5.67*** 36.17±12.92*** 56.20±3.55*** 29.7♂ 100 28.81±13.19*** 39.02±10.90 56.60±1.26* 14.9 0.2 ♀ 100 27.14±6.57*** 39.22±13.76*** 61.00±1.76*** 40.7♂ 100 32.28±11.57*** 49.17±16.24** 58.10±1.19*** 44.8Ⅱ0♀ 100 25.22±7.57 33.12±9.87 46.60±3.03♂98 20.59±7.90 38.67±19.04 58.90±0.32 0.1 ♀ 100 34.08±9.65### 37.67±13.09## 57.00±1.49### 13.7♂ 100 29.60±13.05### 42.67±16.45 59.20±0.42 10.3 0.2 ♀ 100 26.30±7.03 42.57±11.35## 58.30±1.77### 28.5♂ 100 41.51±10.63### 48.04±10.34###0♀

3 討論

從表1～3可以得出，這兩種殘疾模型的果蠅無(wú)論是交配能力，耐寒能力或者攀爬的能力都不及正常的果蠅，而且都顯示出顯著性差異(P＜0.05)。這些人為的傷害直接使果蠅行動(dòng)不便，也可能直接或間接得使果蠅的代謝方面產(chǎn)生變化，使得它們行為能力的降低。然后將質(zhì)量濃度為0.1%、0.2%的LW－PSB喂飼這兩種模型的殘疾果蠅，從表4可以看出，LW－PSB起到了很好的延緩衰老的作用，顯著延長(zhǎng)了殘疾果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間，平均壽命，最高壽命(P＜0.05)。LW－PSB可以扭轉(zhuǎn)殘疾果蠅的弱勢(shì)狀態(tài)，延長(zhǎng)其壽命，提高其生命活力。果蠅在衰老過程中出現(xiàn)的一些行為能力的改變和功能下降，由很多解釋［7］。本試驗(yàn)認(rèn)為L(zhǎng)W既然有促進(jìn)骨折愈合，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用，那么LW－PSB可能主要是直接促進(jìn)殘疾果蠅足部傷口愈合，調(diào)節(jié)其內(nèi)分泌從而改善殘疾果蠅的代謝情況，通過這兩個(gè)方面而起到延長(zhǎng)壽命，延緩衰老的作用。

［1］Sepulveda S，Shojaeian P，Casandra L.Rauser，et al.Interactions between injury，stress resistance，reproduction，and aging inDrosophila melanogaster［J］.Exp Gerontol，2008，43:136－145.

［2］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:402.

［3］吳春芝，谷福根，劉紅在.六味地黃丸(湯)的臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2005，5(3):189－192.

［4］張娟娟，林海燕.六味地黃湯治療更年期綜合征療效觀察［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，1999，15(2):146－147.

［5］齊春會(huì)，張永祥，沈倍奮.六味地黃方現(xiàn)代藥理學(xué)研究新進(jìn)展［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26(1):57－61.

［6］臧建偉，胡旭光，唐春萍，等.六味地黃湯生物制劑的抗衰老作用［J］.中草藥，2007，38(1):99－100.

［7］Simon A F，Liang D T，Krantz D E.Differential decline in behavioral performance ofDrosophila melanogasterwith age［J］.Mech Ageing Deve，2006，127:647－651.