任愛農(nóng)， 顧學(xué)紅， 王大為

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇南京 210028;2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

清氣涼營注射液是由大青葉，大黃，金銀花，知母，野菊花，淡竹葉經(jīng)提取加工制成的靜脈注射液，具有清氣泄熱、涼營化瘀等功效。臨床上治療流行性出血熱早期發(fā)熱(氣分證及氣營兩燔證)效果顯著。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，“氣”、“營”是指溫?zé)岵〉牟±戆l(fā)展階段，由于氣分及氣營兩燔階段時(shí)，病邪已到氣，并多波及營分，故應(yīng)用清氣涼營注射液治療。對于清氣涼營注射液中結(jié)合型大黃酸的HPLC研究之前已有報(bào)道［1］，而隨著液質(zhì)聯(lián)用儀的廣泛應(yīng)用，尤其是電噴霧(ESI)等軟電離技術(shù)的快速發(fā)展，HPLC/MS直接用于中藥復(fù)雜體系中化合物的定性分析已逐漸成為中藥研究的熱點(diǎn)技術(shù)［2-6］。本實(shí)驗(yàn)對清氣涼營注射液中極性類成分和苷元類成分進(jìn)行分析，采用HPLC/ESI/MS方法，對清氣涼營注射液HPLC圖譜上所顯示的特征譜峰進(jìn)行分析，旨在弄清清氣涼營注射液中特征譜峰的結(jié)構(gòu)及其歸屬，為進(jìn)一步豐富清氣涼營注射液全方的內(nèi)涵奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和藥材

清氣涼營注射液由泰州蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)提供。大青葉來自十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigoticaFort.的干燥葉;金銀花來自忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花;大黃來自蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根及根莖;野菊花來自菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序;知母來自百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖;淡竹葉來自禾本科植物淡竹葉Lophatherum gracile Brongn.的干燥莖葉。以上藥材均由任愛農(nóng)教授鑒定。

1.2 試劑與儀器

Waters2695型液相色譜儀(四元泵、在線脫氣及自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、2996型二極管陣列檢測器);Micromass Quattro micro質(zhì)譜儀，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測器，ESI接口，Masslynx 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Milli-Q純水器(美國)。除甲醇為色譜純外，其余試劑均為分析純。綠原酸(S1，批號:110821-200413)和大黃酸(S2，批號:0757-200206)對照品購自于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 色譜條件

1.3.1 極性類成分色譜條件 色譜柱是Promosil C18柱(4.5 mm × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫見表1;進(jìn)樣量:10 μL;洗脫時(shí)間:90 min;檢測波長:325 nm;柱溫:30℃;流速:0.8 mL/min。

表1 梯度洗脫情況Tab.1 Gradient elution

1.3.2 苷元類成分色譜條件 色譜柱是Promosil C18柱(4.5 mm × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫見表2;進(jìn)樣量:10 μL;洗脫時(shí)間:60 min;檢測波長:440 nm;柱溫:30℃;流速:0.8 mL/min。

表2 梯度洗脫情況Tab.2 Gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化(ESI)源;離子源溫度:120℃;正負(fù)離子同時(shí)檢測;脫溶劑氣(N2)流速:500 L/h;錐孔氣(N2)流速:50 L/h;毛細(xì)管電壓:3.0 kV;掃描范圍m/z:150～650;錐孔電壓:30 V;碰撞氣體為氬氣(Ar);碰撞室能量:40 V。

1.5 供試品的制備

1.5.1 極性類成分的制備 取清氣涼營注射液2 mL，過 0.45 μm 微孔濾膜，備用。

1.5.2 苷元類成分的制備 取清氣涼營注射液10 mL，加過氧化氫1 mL，鹽酸2 mL，加熱回流1 h，冷卻至分液漏斗中，乙醚提取3次，每次20 mL，合并提取液，并水洗至中性，揮盡乙醚，加甲醇定容至2 mL作為供試品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

1.5.3 對照品的制備 取綠原酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液作為對照品溶液。取大黃酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液作為蒽醌類成分檢測的對照品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC/UV檢測

實(shí)驗(yàn)中對清氣涼營注射液中極性類成分和苷元類成分進(jìn)行分析，僅用單組分流動(dòng)相很難達(dá)到很好的效果，因此選用以上含兩種不同組分的流動(dòng)相進(jìn)行分析。通過比較，酸性條件下指紋圖譜中的峰形較好，出峰時(shí)間穩(wěn)定，所以選擇甲醇－0.2%醋酸水溶液作為流動(dòng)相。在極性類成分分析中，因?yàn)榻Y(jié)果中多含有酸性成分如綠原酸及其異構(gòu)體等，所以在325 nm處出現(xiàn)的譜峰信息較多，并且峰形較好;而在苷元類成分分析中，因?yàn)槎嘁苑街写簏S中含有的蒽醌類為主，所以選擇在440 nm處觀測，該波長下峰形較好，出峰時(shí)間穩(wěn)定。結(jié)果見圖1。

2.2 圖譜中各峰藥材歸屬

按照注射液制備工藝分別提取制備了只含有單味藥材的注射液，而含苷元類藥材按照注射液提取工藝提取后再進(jìn)行水解并分析，以考察藥材與注射液之間的相關(guān)性，金銀花，野菊花，知母，淡竹葉按照1.3.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣，大黃按照1.3.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。由圖2A 可以看出峰1，2，3，4，6，7，9在金銀花與野菊花中均有出現(xiàn)，而峰10，11在野菊花中出現(xiàn)，其相對應(yīng)的紫外吸收也相同，峰5未在任何藥材中出現(xiàn)，可能是在注射液制備過程中產(chǎn)生的新的化合物。由圖2B可以看出12，13，14，15均在大黃藥材中出現(xiàn)，推測這4個(gè)峰是大黃蒽醌類化合物。

圖1 清氣涼營注射液HPLC/UV指紋譜圖Fig.1 The HPLC/UV fingerprint of Qingqi Liangying Injection

圖2 清氣涼營注射液與藥材指紋圖譜相關(guān)性比較Fig.2 The relativity between the fingerprints of Qingqi Liangying Injection and medical material

2.3 HPLC/MS檢測

圖3 清氣涼營注射液HPLC/MS譜圖ESI(－)Fig.3 The HPLC/MS spectra of Qingqi Liangying Injection ESI(－)

分別以正、負(fù)離子模式全面檢測清氣涼營注射液中各類化合物。經(jīng)條件優(yōu)化，最終確定了1.4和1.3項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件。結(jié)果顯示大部分峰的負(fù)離子吸收比正離子吸收明顯。清氣涼營注射液的HPLC/MS指紋圖譜見圖3。通過所得到的一級質(zhì)譜碎片離子數(shù)據(jù)并參考相關(guān)文獻(xiàn)，對注射液HPLC圖譜中的部分共有峰進(jìn)行了初步定性分析。

2.3.1 極性類成分的質(zhì)譜分析 根據(jù)綠原酸對照品峰的保留時(shí)間和紫外光譜數(shù)據(jù)，推出峰2為綠原酸，而質(zhì)譜數(shù)據(jù)(在負(fù)離子模式下有響應(yīng)較高的253峰［M-H］-離子，而在正離子模式下有277峰［M+Na］+離子)也進(jìn)一步確定了峰2是綠原酸;峰1和峰3具有與綠原酸相同的響應(yīng)峰，即在負(fù)離子模式下有響應(yīng)較高的253峰［M-H］-離子，和正離子模式下有277峰［M+Na］+離子，推測峰1和峰3為綠原酸的同分異構(gòu)體新綠原酸和隱綠原酸，根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］可以推斷出峰1為新綠原酸，峰3為隱綠原酸。

峰4的［M-H］-離子的m/z為179，而其正離子吸收不明顯，但其紫外吸收與綠原酸相近，都在193，218，323 nm出有最大吸收，并且藥材歸屬到金銀花與野菊花中，因此推測為咖啡酸。

峰6，峰7和峰9負(fù)離子模式下具有相同的515峰［M-H］-離子并且在正離子模式下同樣具有540峰［M+Na］-離子，推測為異綠原酸異構(gòu)體，通過文獻(xiàn)［8-9］，異綠原酸B和異綠原酸A的保留時(shí)間相近，且異綠原酸B先于異綠原酸A出峰，從而可以推出峰6為異綠原酸B，峰7為異綠原酸A，而峰9為異綠原酸C。

峰8的負(fù)離子模式下有較高的447峰［M-H］-離子，且在正離子模式下有較高的449峰［M+H］+離子和287峰［M-glu+H］+離子，而金銀花及其野菊花中都含有豐富的木犀草苷［10-11］，因此我們推測峰8為木犀草苷。

峰11負(fù)離子模式下有較高的591峰［M-H］-離子，正離子模式下具有較高的593峰［M+H］+離子，因此推測為蒙花苷。

峰5和峰10在正負(fù)離子模式下均無明顯吸收。

2.3.2 苷元類成分的質(zhì)譜分析 根據(jù)大黃酸對照品峰的保留時(shí)間和紫外光譜數(shù)據(jù)，推出峰14為大黃酸，而質(zhì)譜數(shù)據(jù)(在負(fù)離子模式下有響應(yīng)較高的283峰［M-H］-離子和 239［M-CO2-H］-離子，而在正離子模式下有285峰［M+Na］+離子)也進(jìn)一步確定了峰14是大黃酸。

峰12在正負(fù)離子模式下均無明顯吸收。

峰13和峰15的負(fù)離子模式下有都較高的269峰［M-H］-離子，且在正離子模式下都有較高的271峰［M+H］+離子，猜測這兩個(gè)化合物為大黃蒽醌類中的同分異構(gòu)體蘆薈大黃素和大黃素，根據(jù)文獻(xiàn)［12-13］，可以看出蘆薈大黃素先于大黃素出峰，因此峰13為蘆薈大黃素，而峰15為大黃素?？偨Y(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過HPLC/ESI/MS聯(lián)用的方法對清氣涼營注射液中極性類成分和苷元類成分進(jìn)行定性檢測，結(jié)果顯示該方法將檢測到的15個(gè)峰中的12個(gè)峰的化學(xué)結(jié)構(gòu)初步推斷出來，極性類成分中大部分為綠原酸及其異構(gòu)體和異綠原酸及其異構(gòu)體，而苷元類成分全部是大黃蒽醌類化合物，這一結(jié)果為清氣涼營注射液的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。同時(shí)由于該方法能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)有效組分的良好分離并提供各峰的組成和結(jié)構(gòu)信息，在中藥復(fù)雜體系研究及其質(zhì)量控制方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

表3 峰1-15的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和紫外數(shù)據(jù)Tab.3 The MS and UV date of the peaks 1-15

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