任愛農(nóng)， 姚苗苗， 王大為

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028;2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

紅花注射液是以菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.為原料制成的注射液，具有活血化瘀功能，臨床用于治療閉塞性腦血管疾病，冠心病，脈管炎。主要含有紅花中水溶性較強(qiáng)的黃色素類成分。近代研究表明紅花的黃色素類成分為活血化瘀的主要成分，可抑制血小板激活因子誘發(fā)的血小板聚集與釋放，為一血小板激活因子受體拮抗劑［1-4］，但是它的熱不穩(wěn)定性也屢見報(bào)道［5-9］。我們曾采用HPLC方法對原藥材進(jìn)行了檢測［10］，還采用了指紋圖譜檢測方法對紅花氯化鈉大輸液制備過程中的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了跟蹤考察［11］;本實(shí)驗(yàn)又應(yīng)用 HPLC/UV/MS聯(lián)用技術(shù)對紅花注射液中熱轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行研究，將HPLC對復(fù)雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性、高靈敏度以及能夠提供分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，對紅花黃色素的熱不穩(wěn)定性進(jìn)行深層次的分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters-2695型HPLC色譜儀(四元泵、在線脫氣及自動進(jìn)樣系統(tǒng)、2996型二極管陣列檢測器);Micromass公司Quattro micro質(zhì)譜儀，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測器，ESI接口，Masslynx 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Milli-Q純水器(美國)。除乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。

1.2 試劑與樣品 乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，超純水;紅花購于四川簡陽，由南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授進(jìn)行品種和質(zhì)量鑒定;紅花注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司，規(guī)格:20 mL，批號:070407;亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格:20 mL，批號:070110-1);羥基紅花黃色素A(批號111637-200502)購于中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備 取紅花注射液直接作為供試品(1);再取紅花藥材粉末(過3號篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入雙蒸水100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用雙蒸水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL作為供試品溶液(2);再取續(xù)濾液50 mL置100 mL圓底燒瓶中100℃加熱回流2 h，作為供試品溶液(3)。取對照品羥基紅花黃色素A(safflomin A)用雙蒸水制成質(zhì)量濃度為0.075 1 mg/mL對照品溶液。

2.2 色譜/質(zhì)譜條件及分析方法 色譜柱Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相 乙腈(A)－0.2%乙酸(B)，梯度洗脫(0 ～30 min，10%A;30 ～50 min，15%A;50 ～ 55 min，25%A;55 ～ 60 min，10%A);體積流量 0.7 mL/min，檢測波長 403 nm，310 nm;柱溫30℃。柱后分流0.4 mL/min進(jìn)質(zhì)譜儀，同時(shí)記錄總離子流(TIC)色譜圖。檢測方式ESI(+/－);掃描范圍100～1 000;干燥氣體積流量;10 L/min;霧化室壓40 psi;毛細(xì)管電壓4 000 V;傳輸電壓70 eV。進(jìn)樣量20 μL。

2.3 HPLC/UV/MS色譜圖的建立

2.3.1 色譜分離 實(shí)驗(yàn)過程中嘗試用水-甲醇、水-乙腈體系的分離，發(fā)現(xiàn)乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，分離較好;在水相中加入乙酸使流動相體系呈弱酸性，能有效改善峰形和分離度，所以確立了2.2項(xiàng)下色譜條件對供試品和對照品進(jìn)行分離;并且通過DAD檢測器在200～600 nm范圍內(nèi)全波長掃描。供試品(1):當(dāng)波長在403 nm時(shí)，10 min左右處呈現(xiàn)羥基紅花黃色素A色譜峰、21 min左右處又呈現(xiàn)出一個(gè)峰;波長在310 nm時(shí)33 min處又見一個(gè)明顯色譜峰。供試品(2):當(dāng)波長在403 nm時(shí)10 min左右處呈現(xiàn)羥基紅花黃色素A色譜峰、21 min左右和42 min左右處又各出現(xiàn)一個(gè)明顯的吸收峰，310 nm波長時(shí)無明顯色譜峰，供試品(3)當(dāng)波長在403 nm時(shí)羥基紅花黃色素A和21 min左右的峰仍然存在，42 min左右時(shí)的色譜峰消失，310 nm波長時(shí)33 min左右處新產(chǎn)生了一個(gè)明顯的吸收峰，所以，確立403 nm、310 nm為色譜圖的檢測波長。紅花注射液和紅花水提取液受熱前后的HPLC/UV的色譜圖見圖1。

2.3.2 質(zhì)譜檢測 為全面檢測紅花注射液及紅花水溶液受熱成分變化情況，分別以正、負(fù)離子模式檢測。紅花注射液是以紅花為原料制成的注射液，其主要有效成分為查爾酮類物質(zhì)。該類成分除21 min左右的峰僅適合在負(fù)離子模式下檢測，其余各峰在正、負(fù)離子檢測模式下均可檢測，但是在負(fù)離子檢測模式時(shí)效果更好。紅花注射液及紅花水溶液受熱前后的HPLC/MS TIC圖，見圖2。

圖2是在2.2質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析得到的負(fù)離子掃描圖，結(jié)合正離子掃描結(jié)果，各分子離子的信息見表1。

表1 圖2中推導(dǎo)的4個(gè)可能化合物Tab.1 The four possible compounds derived in Fig.2

2.4 質(zhì)譜解析結(jié)果 由表1可見1號峰與羥基紅花黃色素A對照品比較可確定為羥基紅花黃色素A;2號峰可能是羥基紅花黃色素A的同分異構(gòu)體;3號峰初步推測為查爾酮類物質(zhì);4號峰初步推測為橙酮類物質(zhì)。

3 討論

圖1 紅花注射液和紅花水提取液受熱前后的HPLC/UV色譜圖Fig.1 HPLC/UV characteristic peaks of Honghua Injection and Carthami Flos extract water before and after being heated

圖2 紅花注射液和紅花水提取液受熱前后的HPLC/MS總離子流圖［ESI(－)］Fig.2 HPLC/MS total ion chromatograms［ESI(－)］of Honghua Injection and Carthami Flos extract water before and after being heated

3.1 由紅花注射液、紅花水提液受熱前后色譜圖可見10 min左右的羥基紅花黃色素A峰及22 min左右的峰對熱較穩(wěn)定，在紅花藥材及紅花注射液中均出現(xiàn);33 min左右時(shí)出現(xiàn)的峰為紅花水提取液受熱轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，紅花藥材中沒有，在紅花注射液中含有，說明該種成分是在紅花注射液制備過程中受熱轉(zhuǎn)化所致;42 min左右時(shí)的峰對熱不穩(wěn)定，紅花藥材中有，紅花注射液中沒有，說明該物質(zhì)在紅花注射液制備過程中受熱被破壞了。

3.2 紅花注射液所含成分復(fù)雜，并且由于紅花黃色素受熱不穩(wěn)定的特點(diǎn)，增加了其特殊性。33 min左右時(shí)的峰是熱轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，未見該物質(zhì)有關(guān)報(bào)道，本文首次報(bào)道了該物質(zhì)的熱轉(zhuǎn)化，但是，僅展示了該物質(zhì)的分子量和紫外光譜特征，更深層次的結(jié)構(gòu)特征和藥理活性有待于進(jìn)一步研究。

3.3 42 min左右時(shí)出現(xiàn)的峰是原紅花藥材中固有的，量較高，可能具有類似紅花樣的作用，有文獻(xiàn)報(bào)道為紅花黃色素A(Safflower yellow A)，相對分子質(zhì)量是594［12-13］，這可能是質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)時(shí)分子質(zhì)量范圍窄濾除了分子質(zhì)量大的物質(zhì)而引起的。我們的研究結(jié)果分子質(zhì)量是1 043，對此物質(zhì)未見紅花成分研究中有關(guān)報(bào)道，可能是該物質(zhì)對熱不穩(wěn)定性失去了它的研究價(jià)值，這提示我們可通過分子修飾增加結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

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