孫艷濤， 王 冰， 李 莉

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、山銀花 L.confusa DC.或毛花柱忍冬L.dasystylaRehd.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用，主要有效成分為木犀草素和綠原酸［1］。連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspense(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的作用，含有連翹苷、連翹脂素等有效成分［2］。中藥藥對是符合中醫(yī)理論和組合法度并通過臨床應(yīng)用被證明有實(shí)效的相對固定的二味或三味藥的配伍形式［3］。金銀花、連翹配伍使用歷史非常悠久，既可用于外感溫?zé)?，能解表，又能用于泄里熱而解毒，二者配伍用最早出自清代吳鞠通《溫病條辨》銀翹散［4］。當(dāng)前對金銀花、連翹藥對的研究主要集中于定量測定和藥效學(xué)等方面。如林麗美等人［5］采用RP-HPLC梯度洗脫法對金銀花和連翹單煎、單煎后合并及混煎后綠原酸和連翹脂苷A進(jìn)行了測定，林麗美等［6］采用對比法考察了4個不同配比金銀花連翹藥對的抗炎、解熱作用，邢學(xué)鋒等［7］采用GC-MS對金銀花、連翹和金銀花連翹藥對的揮發(fā)油成分進(jìn)行了分析。本試驗(yàn)通過HPLC法對7種不同配比金銀花連翹藥對的乙醇提取物中綠原酸［8］和連翹脂素［9］進(jìn)行測定，比較不同配比銀翹藥對中指標(biāo)成分的差異，為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 U-3010型分光光度計(jì);Agilent 1100高效液相色譜儀，配備四元梯度泵、VWD檢測器、連接在線脫氣機(jī);METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士)。

1.2 試藥 金銀花、連翹(購于大連開發(fā)區(qū)保健大藥房)經(jīng)藥學(xué)院鑒定教研室王榮祥老師鑒定為正品藥材。綠原酸(購于中國藥品生物制品檢定所，批號:110753-200212);連翹脂素(購于成都思科華生物技術(shù)有限公司，批號:487-39-8);乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純);水為重蒸餾水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱 Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動相乙腈(A)-0.4% 磷酸溶液(B);柱溫35℃;體積流量1.0 mL/min;梯度洗脫見表1，檢測波長330 nm。

表1 流動相洗脫程序Tab.1 Gradient elution

2.2 對照品貯備液的制備 分別精密稱取綠原酸和連翹脂素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成分別含1.25 mg/mL、1.46 mg/mL 的溶液，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取金銀花、連翹藥對約5 g，精密稱定。加入 100 mL 60% 乙醇回流［10］1.5 h后濃縮至50 mL，搖勻;精密吸取5 mL至10 mL量瓶并用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取綠原酸貯備液1 mL，連翹脂素貯備液0.5 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為混合對照品溶液。再分別精密吸取混合對照品溶液 2、3、6、10、15、20 μL 注入液相色譜儀測定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以線性回歸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系結(jié)果Tab.2 Regression data and linear ranges

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取1∶1配比金銀花連翹藥對樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄各色譜峰的峰面積，計(jì)算綠原酸、連翹脂素峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%。結(jié)果顯示，儀器精密度較好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取1∶1配比金銀花連翹藥對樣品，按 2.3 項(xiàng)下方法制備，在 0、2、4、8、12 h 分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、連翹脂素峰面積的RSD分別為2.1%、2.3%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取1∶1配比金銀花連翹藥對樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析，每次10 μL，記錄兩種指標(biāo)成分的色譜峰的峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、連翹脂素含量的 RSD分別為1.7%、1.4%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知綠原酸(3.302 mg/g)、連翹脂素(1.154 mg/g)量的藥對6份，每份約5 g，分別精密加入綠原酸和連翹脂素對照品貯備液適量，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液并進(jìn)樣分析，結(jié)果見表3，綠原酸的平均回收率為99.41%，RSD為1.7%;連翹脂素的平均回收率為99.66%，RSD為1.2%，表明本方法回收率較高。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test

2.5 樣品測定 分別取不同配比的金銀花連翹藥對5 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定各配比藥對中綠原酸、連翹脂素的量，專屬性結(jié)果見圖1。結(jié)果見表4。

3 小結(jié)與討論

3.1 根據(jù)《中國藥典》并結(jié)合各種含金銀花、連翹的用量及配伍關(guān)系，確定7個配伍關(guān)系，并對不同配伍的藥對中綠原酸和連翹脂素的量進(jìn)行測定。

3.2 本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在金銀花和連翹中的大部分指標(biāo)性成分都具有水溶性差的特點(diǎn)，但金銀花和銀翹藥對中量較高的特征有效成分——綠原酸的極性又非常大，故選用梯度洗脫才能對銀翹藥對的有效成分進(jìn)行準(zhǔn)確測定。通過預(yù)試驗(yàn)將檢測波長確定為330 nm。

圖1 對照品(A)、樣品(B)的HPLC圖譜1.綠原酸 2.連翹脂素Fig.1 HPLC chromatograms of standards(A)、sample(B)1.chlorogenic acid 2.forsythiaside

表4 樣品測定結(jié)果 (n=3)Tab.4 Determination results of samples (n=3)

3.3 經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過本試驗(yàn)方法對藥對有效成分進(jìn)行提取后，原金銀花中有效成分木犀草素和連翹中有效成分連翹苷經(jīng)HPLC檢測均不顯著，可能是配制成藥對后在提取過程中兩種有效成分發(fā)生了化學(xué)變化，應(yīng)對其進(jìn)行深入研究，故本試驗(yàn)未將其作為指標(biāo)成分加以檢測。

3.4 通過對比定量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于兩種有效成分綠原酸和連翹脂素的量均與藥對中相應(yīng)的藥材量的增加有增加的趨勢。但細(xì)致比較可以發(fā)現(xiàn)作為金銀花中的有效成分綠原酸和作為連翹中有效成分的連翹脂素量的變化與不同配比藥對中相應(yīng)成分金銀花以及連翹無顯著的比例關(guān)系，當(dāng)每種成分對另一種成分的配比達(dá)到2∶1以上時，其量均無顯著增加，這應(yīng)與藥對之間的相互作用有關(guān)。藥對配比為1∶1時，兩種指標(biāo)性成分量都比較高，這與各種古方中金銀花、連翹比例為1∶1可能會存在一定的關(guān)系，應(yīng)該進(jìn)一步深入研究。

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