周 欣， 宋粉云， 鐘兆健， 李健奇

(廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

窈窕茶為香港北京制藥廠提供，是由決明子、枳實(shí)、厚樸、陳皮等藥材經(jīng)粉碎后制成的茶包，具有通便散熱結(jié)、利水消腫、理氣健脾的功效，臨床主要用于治療腸胃積熱、水濕內(nèi)停導(dǎo)致的肢體沉重浮腫，大便秘結(jié)、腹脹、腹痛，口干口燥，小便不利等癥狀。該產(chǎn)品尚未見(jiàn)相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)報(bào)道，為評(píng)價(jià)窈窕茶的質(zhì)量，確保臨床療效，本實(shí)驗(yàn)研究建立了決明子、枳實(shí)、厚樸的薄層色譜鑒別方法，該方法簡(jiǎn)便、可行，重復(fù)性好;其中厚樸具有燥濕消痰、下氣除滿的作用，常用于食積氣滯、腹脹便秘等癥狀的治療［1］，是窈窕茶的重要組成部分，厚樸的主成分為厚樸酚及和厚樸酚，因此通過(guò)采用反相高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定來(lái)對(duì)該藥進(jìn)行質(zhì)量控制［2-4］，該法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 儀器和試藥

安捷倫公司生產(chǎn)Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100系列雙元泵，Agilent 1100 nm可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，Agilent 1100/化學(xué)工作站;昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)超聲波清洗器 KQ5200［頻率:(35±5)%KHz;功率:250 W］。

大黃酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，0796－200105)，大黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，0795－200205)，辛弗林對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，0727－200105)，厚樸酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，110729－200310)，和厚樸酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，110730－200609);窈窕茶(香港北京制藥廠，批號(hào):I0509Y、H1201Y、I0620Y)，規(guī)格為2 g/包;水為雙蒸水，甲醇為色譜純，其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 決明子的鑒別 取窈窕茶內(nèi)容物10 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入20%鹽酸溶液(37%濃鹽酸溶液約27 mL配成50 mL溶液)，超聲30 min，濾過(guò)，用三氯甲烷萃取2次，每次20 mL;合并三氯甲烷層后濃縮至3～5 mL，作為供試品溶液;按此法制得3份不同批號(hào)供試品溶液。取大黃酚、大黃素對(duì)照品適量，加甲醇配成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方從中除去決明子，依法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取3個(gè)批號(hào)供試液和陰性溶液各10 μL，對(duì)照品溶液5 μL;分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-正己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶14∶5 ∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出后晾干。置365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同黃色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 決明子薄層色譜圖1.陰性對(duì)照 2.大黃酚和大黃素對(duì)照品3-5.樣品(I0509Y，I0620Y，H1201Y)Fig.1 TLC of Cassiae Semen1.negative sample without Cassiae Semen 2.reference substances of emodin and chrysophanol 3-5.samples(I0509Y，I0620Y，H1201Y)

2.2 枳實(shí)的鑒別 取窈窕茶內(nèi)容物4 g于100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇40 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液;按此法制得3份不同批號(hào)的供試品溶液。取辛弗林對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方從中除去枳實(shí)，依法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲醇-丙酮-三氯甲烷-濃氨水(3∶4 ∶13 ∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出后晾干，噴以0.5%茚三酮乙醇顯色，在105℃加熱約10 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 厚樸的鑒別 取窈窕茶10 g于100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，密塞，靜置過(guò)夜，超聲30 min，濾過(guò)，取一半濾液水浴蒸干，殘?jiān)?～2 mL甲醇溶解作為供試品溶液;按此法制得3份不同批號(hào)的供試品溶液。取厚樸酚及和厚樸酚對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。按處方從中除去厚樸，依法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(17∶3∶0.4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出后晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中在與對(duì)照品相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 枳實(shí)的薄層色譜圖1-3.樣品(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.辛弗林對(duì)照品 5.陰性對(duì)照Fig.2 TLC of Aurantii Fructus immaturus1-3.sample(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.reference substance of synephrine 5.negative sample without Aurantii Fructus immaturus

圖3 窈窕茶中厚樸的薄層色譜圖1-3.樣品(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.厚樸酚及和厚樸酚對(duì)照品 5.陰性對(duì)照Fig.3 TLC of Magnoliae officinalis Cortex1-3.samples(I0509Y，I0620Y，H1201Y)4.reference substance of magnolol and honokio 5.negative sample without Magnoliae officinalis Cortex

3 樣品測(cè)定

3.1 樣品制備

3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取厚樸酚對(duì)照品11.1 mg置于50 mL量瓶中，和厚樸酚對(duì)照品10.0 mg置于100 mL量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，含厚樸酚為222 μg/mL，和厚樸酚為 100 μg/mL。

圖4 厚樸酚及和厚樸酚高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對(duì)照溶液 1.和厚樸酚 2.厚樸酚Fig.4 HPLC chromatogramsA.mixed reference substances B.sample C.negative sample 1.honokio 2.magnolol

3.1.2 供試品溶液的制備 取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物混勻，取約10 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置過(guò)夜，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。

3.1.3 陰性對(duì)照液的制備 按處方從中除去厚樸，照3.1.2項(xiàng)下的制備方法處理得陰性對(duì)照溶液。

3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為 DiamonsidTM-C18柱(迪馬公司，250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇-0.3%磷酸(68∶32);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm;柱溫30℃。分別取混合對(duì)照品溶液(含厚樸酚為77.7 μg/mL、和厚樸酚為30.0 μg/mL)、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)以厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于15 000，厚樸酚、和厚樸酚的拖尾因子為0.98、1.00;厚樸酚、和厚樸酚與其它組分的分離度都大于1.5;陰性對(duì)照不干擾樣品測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別吸取一定量的厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品貯備液，混合，加甲醇稀釋成厚樸酚質(zhì)量濃度為 44.4、55.5、66.6、77.7、88.8、99.9、111.0 μg/mL，和厚樸酚質(zhì)量濃度為 15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0 μg/mL 的溶液。依次進(jìn)樣10 μL，每個(gè)濃度測(cè)定3次以上。以峰面積(A)及對(duì)照品溶液系列濃度(C)進(jìn)行回歸，得厚樸酚回歸方程A=12.18C－26.55，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3;和厚樸酚回歸方程為A=13.98C－4.63，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。表明厚樸酚質(zhì)量濃度在 44.4 ～ 111.0 μg/mL 之間、和厚樸酚質(zhì)量濃度在 15.0 ～45.0 μg/mL之間與峰面積線性關(guān)系良好。

3.3.2 精密度試驗(yàn) 取厚樸酚質(zhì)量濃度為77.7 μg/mL、和厚樸酚為30.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)定5次，RSD分別為1.28%和1.52%，表明儀器精密度良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)I0509Y)在0、2、4、6、8、12 h 分別進(jìn)樣 10 μL，RSD 分別為0.95%和1.24%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)I0509Y)樣品6份，按3.1.2項(xiàng)下的制備方法處理、分別測(cè)定3次，結(jié)果厚樸酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.88 mg/g，RSD為1.83%;和厚樸酚平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.33 mg/g，RSD為2.30%，表明分析方法重復(fù)性良好。

3.3.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取窈窕茶樣品(批號(hào)I0509Y)共6份，加入相應(yīng)量的厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品，按3.1.2項(xiàng)下的制備方法處理并測(cè)定，計(jì)算回收率。厚樸酚平均回收率為 99.2%，RSD為1.53%;和厚樸酚平均回收率為 96.2%，RSD為1.49%，表明本方法準(zhǔn)確可靠，見(jiàn)表1、2。

表1 厚樸酚回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.1 Recovery test results of magnolol(n=6)

表2 和厚樸酚回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)Tab.2 Recovery test results of honokio (n=6)

3.4 樣品測(cè)定 取窈窕茶3個(gè)不同批號(hào)樣品(平均裝量 I0509Y 為2.29 g/袋、H1201Y 為2.24 g/袋、I06620Y 為2.24 g/袋)，按 3.1.2 項(xiàng)下的制備方法處理后測(cè)定，得厚樸酚及和厚樸酚的量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.3 Determination results of samples (n=6)

4 討論

4.1 決明子的薄層鑒別中，提取過(guò)程將提取和水解［1］兩步結(jié)合在一起，改用超聲30 min的方法;并且萃取后對(duì)三氯甲烷層進(jìn)行濃縮而不是蒸干，確保了溶液成分的完整和穩(wěn)定。薄層展開(kāi)中以石油醚(30～60℃)-正己烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶14∶5∶0.1)為展開(kāi)劑［5］，使用硅膠 G 板和 H 板展開(kāi)，均能看到斑點(diǎn)，但用G板展開(kāi)速度明顯快于H板，且薄層斑點(diǎn)效果更清晰。

4.2 枳實(shí)的薄層鑒別中，以甲醇-丙酮-三氯甲烷-濃氨水(3∶4∶13 ∶0.5)為展開(kāi)劑［6-7］，直接點(diǎn)于硅膠G薄層板，噴以0.5%茚三酮乙醇顯色，相較于中國(guó)藥典中采用1%氫氧化鈉堿性硅膠G板［1］，薄層結(jié)果更清晰易見(jiàn)。

4.3 厚樸的薄層鑒別中，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(17 ∶3 ∶0.4)為展開(kāi)劑［8］，取代中國(guó)藥典中以苯-甲醇(27∶1)為展開(kāi)劑［1］，避免了溶劑苯的使用，提高了實(shí)驗(yàn)的安全性。

4.4 關(guān)于HPLC流動(dòng)相的選擇，流動(dòng)相曾直接采用甲醇-水［9］，譜圖中色譜峰的對(duì)稱性都較差，后嘗試采用加入 0.1% ～0.3%的磷酸［10-11］，結(jié)果顯示加入0.3%的磷酸時(shí)，色譜峰對(duì)稱性最好;考察流動(dòng)相甲醇-0.3%磷酸的不同配比，結(jié)果顯示，選用甲醇-0.3%磷酸(68∶32)為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離效果最好，分離度都大于1.5，理論塔板數(shù)不低于15 000。

4.5 關(guān)于陰性色譜圖中12 min和19 min出現(xiàn)的比樣品中大的譜峰是因?yàn)樵陉幮詫?duì)照的制備中使用的藥材與窈窕茶樣品使用藥材并非同一批號(hào)，由于不同規(guī)格、產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間都可能影響藥材中有效成分的量，所以造成在此處某一藥材的成分量偏高，峰面積較樣品突出的原因。從整個(gè)譜圖看，此兩峰并未對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究的厚樸酚及和厚樸酚的定量測(cè)定造成影響。

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