蔣珍藕， 邱宏聰， 韋寶偉， 李 茂， 陸國壽

(廣西中醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530022)

木姜葉柯總黃酮是木姜葉柯的干燥嫩葉經(jīng)提取分離純化的有效部位。木姜葉柯為殼斗科柯屬植物L(fēng)ithocarpus litseifolius(Hance)Chun.［1］的干燥嫩葉，具有清熱解毒，化痰，祛風(fēng)，降壓的作用，主治濕熱瀉痢，肺熱咳嗽，癰疽瘡瘍，皮膚瘙癢，高血壓［2］;現(xiàn)代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分具有降血糖，降血壓，降脂及抗過敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有獨(dú)特的效果［3］，木姜葉柯將可能是一種新型的預(yù)防和治療糖尿病的新藥材。為了有效地控制木姜葉柯總黃酮的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)木姜葉柯有效部位總黃酮的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了研究。

1 儀器、試藥與材料

LC－20A高效液相色譜儀、SPD－20A紫外檢測(cè)器(日本島津公司)，威瑪通用多媒體色譜數(shù)據(jù)工作站;UV2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、B2200S超聲清洗機(jī)(上海必能信超聲有限公司)、LIBROR AEL－200電子天平(日本島津公司)。

根皮苷對(duì)照品:購買于 SIGMA公司，批號(hào)為083K7072，經(jīng)高效液相色譜歸一化法測(cè)定純度在98%以上。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。薄層層析硅膠 G:化學(xué)純，批號(hào)00081107，青島海洋化工有限公司。

5批木姜葉柯總黃酮由本課題組提取制備，分別編號(hào)為 1#、2#、3#、4#、5#，其中 1#～2#為小試樣品、3#～5#為放大驗(yàn)證試制樣品。用于制備總黃酮的木姜葉柯藥材采自廣西蘋果縣海城鄉(xiāng)榮芳村陸擁屯，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥資源所覃德海副研究員及饒偉源副研究員鑒定為殼斗科柯屬植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.的干燥嫩葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取本品細(xì)粉0.1 g，加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取根皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。再取木姜葉柯對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇10 mL超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述三種溶液各2～5 μL，點(diǎn)于同一含0.4%乙酸鈉的以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯－2－丁酮－甲醇－水(10 ∶5 ∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，熱風(fēng)吹數(shù)分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的熒光斑點(diǎn)。經(jīng)多批樣品試驗(yàn)，可作為木姜葉柯總黃酮的定性鑒別方法。

2.2 根皮苷的測(cè)定方法研究

參照文獻(xiàn)［4－5］并經(jīng)試驗(yàn)調(diào)整，采用高效液相色譜法對(duì)木姜葉柯總黃酮中的主要有效成分根皮苷進(jìn)行測(cè)定。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1.1 色譜條件:Thermo HYPERSIL ODS－2(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈－0.1% 磷酸(21∶79);檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量為5 μL。理論板數(shù)按根皮苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。在上述色譜條件下，供試品中根皮苷與其它雜質(zhì)達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，可滿足定量要求。另吸取甲醇溶劑，注入高效液相色譜儀進(jìn)行空白試驗(yàn)，結(jié)果在根皮苷出峰處不出現(xiàn)色譜峰，表明溶劑對(duì)根皮苷測(cè)定不產(chǎn)生干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備:取根皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備:取本品細(xì)粉20 mg，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率80 W，頻率50 kHz)10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 方法學(xué)考察及樣品的測(cè)定

2.2.2.1 線性關(guān)系考察:精密稱取根皮苷對(duì)照品10.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取 0.5、1、2、5、10 mL，分別置 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣5 μL測(cè)定。以根皮苷對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=2 067 966X－22 031.903 7(r=0.999 9)，線性范圍:0.105 ～2.100 μg。

2.2.2.2 精密度試驗(yàn):對(duì)同一供試品溶液(1批)，連續(xù)測(cè)定5次，記錄根皮苷峰面積。結(jié)果RSD為1.67%(n=5)。試驗(yàn)表明，精密度良好。

2.2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn):對(duì)同一供試品溶液(1批)，于0、1、2、4、10、12 h 依法測(cè)定，記錄根皮苷峰面積，結(jié)果RSD為1.73%(n=6)。試驗(yàn)表明，在12 h內(nèi)被測(cè)物穩(wěn)定。

2.2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn):對(duì)同一批樣品(1 批)，平行測(cè)定6份，計(jì)算根皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 299.40 mg/g，RSD 為 1.96%(n=6)。結(jié)果表明，重復(fù)性較好。

2.2.2.5 加樣回收率測(cè)定:精密稱取根皮苷對(duì)照品33.0 mg，置500 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的木姜葉柯總黃酮樣品約10 mg，平行取6份，精密稱定，分別精密加入上述根皮苷對(duì)照品溶液50 mL，按上述擬訂的方法提取、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均加樣回收率為 98.74%，RSD 為 1.70%(n=6)，符合定量分析的要求，詳見表1。

表1 根皮苷回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.2.2.6 樣品測(cè)定:取第3、4、5 批木姜葉柯總黃酮樣品20 mg，各3份，精密稱定，依法制成供試品溶液，依法測(cè)定根皮苷。結(jié)果見表2。

表2 根皮苷測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3 總黃酮測(cè)定方法研究

2.3.1 實(shí)驗(yàn)條件

2.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備:取根皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，即得。

2.3.1.2 供試品溶液的制備:取本品細(xì)粉20 mg，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率80 W，頻率50 kHz)10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液0.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇:吸取根皮苷對(duì)照品溶液及供試品溶液各適量，以甲醇做空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)200～400 nm波長(zhǎng)下掃描，結(jié)果根皮苷對(duì)照品及供試品均在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇280 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 方法學(xué)考察及樣品的測(cè)定

2.3.2.1 線性關(guān)系考察:精密稱取根皮苷對(duì)照品13.01 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取 0.5、1、2、5、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為對(duì)照品溶液，于280 nm處測(cè)定吸光度(A值)。以根皮苷濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，A值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=0.0399X－0.0007(r=0.999 9)，線性范圍:2.602 ～ 36.428 μg/mL。

2.3.2.2 精密度試驗(yàn):對(duì)同一份供試品溶液(2批)，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，結(jié)果RSD為0.38%(n=6)。結(jié)果表明，精密度良好。

2.3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn):對(duì)同一供試品溶液(2批)，于0、1、2、4、8、12 h 依法測(cè)定吸光度，結(jié)果 RSD 為0.69%(n=6)。結(jié)果表明，在12 h內(nèi)測(cè)定保持穩(wěn)定。

2.3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn):對(duì)同一批樣品(2 批)，平行測(cè)定6份樣品的總黃酮，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.67%，RSD 為1.65%(n=6)。結(jié)果表明，重復(fù)性較好。

2.3.2.5 加樣回收率測(cè)定:取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的木姜葉柯總黃酮樣品約10 mg，平行取6份，精密稱定，分別精密加入根皮苷對(duì)照品7 mg，按上述擬訂的方法提取、測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.49%，RSD 為 1.37%(n=6)，符合定量分析的要求，詳見表3。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果

2.3.2.6 樣品測(cè)定:精密稱取 3、4、5 批木姜葉柯總黃酮樣品20 mg，各3份，依法制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 總黃酮測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 供試品溶液提取時(shí)間的選擇 分別對(duì)超聲10、20、30 min的供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果隨著時(shí)間的增加，總黃酮增加不明顯，說明超聲處理10 min已能將被測(cè)成分基本提取完全，同時(shí)考慮到實(shí)驗(yàn)效率和成本，故采用超聲處理10 min作為提取時(shí)間。

3.2 總黃酮的測(cè)定經(jīng)典的方法是以蘆丁為對(duì)照品比色測(cè)定［6－8］，為此，本實(shí)驗(yàn)也曾以蘆丁為對(duì)照品，通過絡(luò)合比色法測(cè)定木姜葉柯中總黃酮，但針對(duì)性不強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果不理想。這可能是由于蘆丁屬于黃酮醇類化合物(結(jié)構(gòu)為5、7、3′、4′－ 四羥基黃酮 －3 － 蕓香糖苷)，木姜葉柯中黃酮成分主要為二氫查耳酮類化合物，與蘆丁在結(jié)構(gòu)上差異較大，因此蘆丁不適合用于木姜葉柯總黃酮成分測(cè)定。之后，本實(shí)驗(yàn)選擇木姜葉柯中主要成分根皮苷為對(duì)照品，采用直接紫外測(cè)定法測(cè)定總黃酮，結(jié)果可靠。

3.3 本實(shí)驗(yàn)除了建立薄層色譜定性鑒別外，還采用高效液相色譜法對(duì)主要有效成分根皮苷進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)還采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮。因此，本文所建立的質(zhì)量控制方法能比較全面地、有效地控制木姜葉柯總黃酮質(zhì)量。

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