劉翠華 黃紅娜 王琪 鄭焙文 朱寶利

(中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101)

結(jié)核分枝桿菌中的泛素樣蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)研究進(jìn)展

劉翠華 黃紅娜 王琪 鄭焙文 朱寶利

(中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriu m tuberculosis,Mtb)是引起結(jié)核病這一嚴(yán)重威脅全球人類健康的災(zāi)難性傳染病的病原體。它具有很強(qiáng)的生存能力,可在巨噬細(xì)胞中以一種潛伏的狀態(tài)長期存在;并且其細(xì)胞壁厚,抗菌藥物難以透過,加之其生長緩慢,抗結(jié)核治療不當(dāng)易使其產(chǎn)生耐藥菌株。近年來由耐藥Mtb引起的耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB,MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drugresistant TB,XDR-TB),以及全耐藥結(jié)核病(totally drug-resistant TB,TDR-TB)的出現(xiàn),加之 Mtb與艾滋病病毒雙重感染疫情的上升,使得全球結(jié)核病防治工作當(dāng)前面臨的形勢依然十分嚴(yán)峻[1-2]。與普通的結(jié)核病的治療相比,對(duì)這些類型的耐藥結(jié)核病的治療更加昂貴和困難,并且其治療失敗率和死亡率也明顯增加。因此,尋找新的更有效的抗結(jié)核藥物作用靶點(diǎn)對(duì)于結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療已刻不容緩[3-4]。

大量研究表明泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitinproteasome system,UPS)介導(dǎo)的真核細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)選擇性降解途徑調(diào)控著動(dòng)植物體內(nèi)包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)等幾乎所有的生命活動(dòng),并參與病原體的入侵、致病和機(jī)體的免疫應(yīng)答等過程[5-7]。許多醫(yī)藥研發(fā)機(jī)構(gòu)正在研制以UPS為靶標(biāo)的治療癌癥、糖尿病、心血管疾病、炎癥和退行性疾病等的新型藥物。例如,Millennium Pharmaceuticals公司研發(fā)的一種蛋白酶體抑制劑Velcade(bortezomib)已獲得美國食品與藥品管理局的批準(zhǔn),被用于治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤[4]。與真核類似的蛋白酶體雖然早就在細(xì)菌和古生物中被發(fā)現(xiàn),但在很長時(shí)期內(nèi),泛素(Ub)和類泛素(ubiquitin-likes,UBLs)卻沒有成功地在原核生物中被確認(rèn),因此人們曾認(rèn)為它們不存在于原核生物中。直到最近研究者才在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)了與真核生物中的泛素類似的原核生物泛素樣蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)[8-9]。研究表明,雖然結(jié)核分枝桿菌中的Pup-蛋白酶體系統(tǒng)(Pup-proteasome system,PPS)與真核生物中的UPS存在某些細(xì)微的差別,但在整體結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的相似性。Mtb中的PPS也主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)蛋白質(zhì)的選擇性降解,并對(duì)Mtb的毒力及其引起的宿主免疫應(yīng)答等過程起重要調(diào)控作用[10-12]。因此,基于PPS在Mtb致病過程中的重要作用,加之其與真核UPS之間存在某些差異,使得其可能成為新的抗結(jié)核治療的理想靶標(biāo),筆者就PPS的研究進(jìn)展及其在抗結(jié)核治療藥物研發(fā)中的價(jià)值等作一綜述。

1 Pup的結(jié)構(gòu)

Mtb中的Pup是成對(duì)的蛋白質(zhì),紫外圓二色光譜(CD)和核磁共振光譜(NMR)組合的多樣化結(jié)構(gòu)預(yù)測證實(shí)Pup有64個(gè)氨基酸,是一種C-末端區(qū)域呈螺旋狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂的蛋白質(zhì)[13-14]。Pup含有獨(dú)特的區(qū)域與Pupulation酶(Pupulation enzymes)相互作用并引發(fā)底物蛋白的蛋白酶體降解,其螺旋狀C-末端介導(dǎo)其與底物蛋白質(zhì)的連接,而其氨基末端則對(duì)于其降解功能的發(fā)揮是必需的[15]。雖然Pup與真核生物中不同的泛素樣蛋白質(zhì)只享有很低的序列相似性,但其3D結(jié)構(gòu)卻顯示它具有高度保守的典型泛素樣折疊結(jié)構(gòu)。此外,1H-15N NOE(Nuclear Overhauser Effect)數(shù)據(jù)和CSI(Chemical Shift Index)分析顯示Pup的C-末端有1個(gè)二維結(jié)構(gòu)的殘基,這些特征使得Pup與其他泛素樣蛋白超家族得以區(qū)分開來[14]。盡管Pup與泛素在序列和對(duì)蛋白底物的靶向連接過程等方面存在某些差異,但兩者在介導(dǎo)蛋白底物的蛋白酶體靶向降解方面發(fā)揮著類似的作用[8-9]。

2 Mtb蛋白酶體的結(jié)構(gòu)

Mtb的蛋白酶體為750 kDa,其結(jié)構(gòu)與真核生物的蛋白酶體相似,也呈桶狀結(jié)構(gòu),包含由α亞基形成的2個(gè)7元外環(huán)和由β亞基形成的2個(gè)7元內(nèi)環(huán)。蛋白水解發(fā)生在β亞基N-末端的蘇氨酸上。真核生物蛋白酶體含有7種α亞基和7種β亞基,其中只有 3 種β亞基(β1、β2、β5)顯示蛋白水解活性。相比較而言,原核生物蛋白酶體則通常包括1種或2種類型的α和β亞基,其中Mtb蛋白酶體的β亞基為單一類型,并且14個(gè)β亞基中的每一個(gè)均提供1個(gè)N末端蘇氨酸的活性位點(diǎn)[16]。Mtb蛋白酶體核心顆粒的冷凍電鏡技術(shù)顯示其具有1個(gè)閉合的尾部,與負(fù)染色電鏡技術(shù)所顯示的密度測定結(jié)果是一致的。α-亞基N-末端八倍體的存在進(jìn)一步提示Mtb蛋白酶體含有1個(gè)門控式結(jié)構(gòu)[17]。真核生物蛋白酶體的核心顆?？赏ㄟ^7個(gè)α亞基的不同氨基末端肽關(guān)閉其蛋白底物的入口,而Mtb蛋白酶體的晶體結(jié)構(gòu)則提示其核心顆粒的門控是被7個(gè)相同的肽通過3種不同的構(gòu)象緊緊密封的[18]。

3 結(jié)核分枝桿菌中的PPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程

真核生物中的泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)的底物蛋白的降解主要由底物泛素化和蛋白酶體降解2個(gè)步驟組成。在底物泛素化過程中,Ub在ATP供能的條件下依次通過泛素活化酶(E1)、泛素載體蛋白(E2s),以及泛素連接酶(E3s)等的一系列催化步驟而與底物蛋白結(jié)合。具多聚泛素鏈修飾的蛋白質(zhì)最終被送到由多個(gè)亞單位組成的龐大的26S蛋白酶體中降解成小肽段,同時(shí)多聚泛素鏈被去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)從底物上水解下來并解聚為單個(gè)Ub分子而被重新利用[5]。

Mtb中的PPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程如圖1所示。與真核生物中的泛素化過程類似,Mtb中的Pup通過pupylation反應(yīng)后使底物蛋白被標(biāo)記上Pup并隨之被蛋白酶體降解[19]。pupylation過程雖然類似于泛素化,但其酶學(xué)反應(yīng)過程與泛素化過程不盡相同。pupylation過程獨(dú)特的方面主要包括：Pup活化的機(jī)制及其與底物的連接過程、Pup與賴氨酸連接有關(guān)的反應(yīng)過程,以及此過程中對(duì)蛋白酶體附屬因子 A(proteasome accessory factor A,PafA)的依賴性等[15,20]。pupylation過程包括1個(gè)獨(dú)立的脫酰胺作用和1個(gè)接合反應(yīng),分別通過Pup的脫酰胺酶(deamidase of pup,Dop)和Pup連接酶PafA來催化。與Ub不同的是,Pup側(cè)鏈末端的谷氨酰胺在連接作用之前首先被Dop脫去酰胺基后變成谷氨酸(此過程需要與ATP的結(jié)合但不是其水解作用)[21],然后在PafA的催化下谷氨酸的1個(gè)羧基通過異肽鍵連接到底物賴氨酸上[22]。與底物的賴氨酸相連接的可能是α-羧基也可能是γ-羧基(此過程需要ATP的水解作用)[10]。最后,Mtb蛋白酶體的ATP酶(Mycobacteriumproteasomal ATPase,Mpa)負(fù)責(zé)將底物運(yùn)載到蛋白酶體內(nèi)使其降解[13]。Pup羧基末端的螺旋部分會(huì)直接以1∶6的比例與Mpa氨基末端卷曲螺旋區(qū)域相互作用[15]。

圖1 M tb中的PPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程

表1 Mtb菌中的PPS與真核生物中的UPS系統(tǒng)的特征比較

真核生物中被鑒定的蛋白酶體底物已不計(jì)其數(shù)。迄今為止,研究者也已在Mtb中鑒定了至少7個(gè)蛋白酶體底物,包括FabD、PanB、Mpa、PhoH2、Icl、MtrA 和 Inol[23]。此外,Pearce等[20]的研究結(jié)果表明PafA的突變會(huì)導(dǎo)致Mtb中底物蛋白pupylation過程的中斷,但Mtb中的PafA與真核生物中的E1、E2s或 E3s都沒有同源性,提示PafA的活性與典型的UBLs是不一樣的。Imkamp等[24]的研究表明Pup特異性的脫酰胺酶Dop的缺失也可阻斷分枝桿菌中底物蛋白的pupylation過程。Cerda-Malra等[22]還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Dop不僅在Pup的脫酰胺作用中是必需的,而且對(duì)于Mtb維持pupylation蛋白質(zhì)野生型的穩(wěn)態(tài)水平也是必需的。此外,他們的研究還表明Dop與PafA均與Mtb的毒力發(fā)揮密切相關(guān)。Wang等[25]的研究表明Mtb中的Mpa與真核生物中的調(diào)節(jié)顆粒ATP酶具有同源性,并參與結(jié)合、去折疊,以及遞送待降解底物至蛋白酶體中心等過程。Mtb中的PPS與真核生物中的UPS的特征比較結(jié)果詳見表1[16]。

4 Mtb中的PPS在抗結(jié)核治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用價(jià)值

Mtb中的PPS不僅是Mtb在宿主體內(nèi)生存和復(fù)制必需的,也是非復(fù)制階段持續(xù)存留在宿主體內(nèi)的決定因素[26]。此外,Mtb中的蛋白酶體對(duì)于Mtb毒力的發(fā)揮也是必需的。例如,Pieters等[27]的研究表明Mtb中的蛋白酶體可以保護(hù)微生物免受吞噬溶酶體中產(chǎn)生的氮氧化物及其衍生物的損傷作用。Gandotra等[28]發(fā)現(xiàn)Mtb中的蛋白酶體還參與Mtb對(duì)小鼠的致病過程。因此,介于Mtb中的PPS在Mtb的生理功能及其致病過程中的重要性,研究者紛紛探尋真核生物 UPS與Mtb中的PPS的差異,并基于兩者的差異尋找抗結(jié)核藥物治療的靶點(diǎn)。最近已有研究結(jié)果表明,與哺乳動(dòng)物的蛋白酶體相比,分枝桿菌的蛋白酶體表現(xiàn)出不同的底物選擇性,這為今后基于分枝桿菌中蛋白酶體的特定活性位點(diǎn)的藥物研發(fā)打下了重要基礎(chǔ)[16]。此外,Mtb中的PPS所特有的翻譯后修飾酶PafA也有望成為抗結(jié)核治療的有效靶點(diǎn)[15,20]。

5 今后的研究方向

雖然將Mtb中的PPS作為抗結(jié)核治療的靶點(diǎn)具有良好的應(yīng)用前景,但仍有很多問題有待進(jìn)一步深入研究：(1)真核生物中的泛素連接酶有三大類且數(shù)量繁多,使得泛素化具有高度選擇性和特異性,而在Mtb中的PPS系統(tǒng)中僅發(fā)現(xiàn)1種Pup連接酶PafA,因此仍未明確單一的PafA是如何將Mtb中眾多的蛋白質(zhì)底物特異地靶向于蛋白酶體的[8,15];(2)目前尚未明確Pup是否像泛素一樣形成聚Pup鏈后被底物識(shí)別;(3)由于目前尚未發(fā)現(xiàn)與去泛素酶類似的Pup解離酶,因此仍不清楚Pup在被異肽鍵連接于底物時(shí),是否會(huì)像真核生物的泛素一樣被解離下來再循環(huán)利用[11];(4)此外,仍不確定是否Pup修飾對(duì)于Mtb中蛋白質(zhì)的蛋白酶體靶向降解是必需的。綜上所述,Mtb中PPS的發(fā)現(xiàn)開啟了以蛋白質(zhì)降解的調(diào)控為特征的抗結(jié)核藥物研發(fā)的大門,隨著研究的深入以及上述問題的進(jìn)一步闡明,以PPS為靶標(biāo)的抗結(jié)核新藥的研發(fā)將會(huì)為結(jié)核病包括耐藥結(jié)核病的治療提供新的有效途徑。

[1]World Health Organization.Anti-tuberculosis drug resistance in the world：fourth global report[R].World Health Organization report 2008.WHO/HTM/TB/2008：394.

[2]Migliori GB,De Iaco G,Besozzi G,Centis R,Cirillo DM.First tuberculosis cases in Italy resistant to all tested drugs[J].Euro Surveill,2007,12(5)：E070517.1.

[3]中國防癆協(xié)會(huì).耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南(2009)[J].中國防癆雜志,2010,32(4)：181-198.

[4]Cheng Y,Pieters J.Novel proteasome inhibitors as potential drugs to combat tuberculosis[J].J Mol Cell Biol,2010,2(4)：173-175.

[5]Goldberg AL.Protein deg radation and protection against misfolded or damaged proteins[J].Nature,2003,426(6968)：895-899.

[6]趙天鎖,任賀,郝繼輝.泛素-蛋白酶體通路的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2009,49(32)：113-114.

[7]陳建華,湯正好.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的關(guān)系[J].國際免疫學(xué)雜志,2010,33(4)：286-289.

[8]Darwin KH.Prokaryotic ubiquitin-like protein(Pup),proteasomes and pathogenesis[J].Nat Rev Microbiol,2009,7(7)：485-491.

[9]Burns KE,Liu WT,Boshoff HI,Dorrestein PC,Barry CE 3rd.Proteasomal protein degradation in My cobacteria is dependent upon a prokary otic ubiquitin-like protein[J].J Biol Chem,2009,284(5)：3069-3075.

[10]Kraut DA,Matouschek A.Pup grows up：in vitrocharacterization of the deg radation of pupylated proteins[J].EM BO J,2010,29(7)：1163-1164.

[11]Festa RA,M cAllister F,Pearce M J,Mintseris J,Burns K E,Gygi SP,Darwin KH.Prokay rotic ubiquitin-like protein(Pup)proteome ofMycobacterium tuberculosis[corrected][J].PLoS One,2010,5(1)：e8589.

[12]Cerda-Maira F,Darwin K H.T heMycobacterium tuberculosisproteasome：more than just a barrel-shaped protease[J].Microbes Infect,2009,11(14/15)：1150-1155.

[13]Sutter M,Striebel F,Damberger FF,Allain FH,Weber-Ban E.A distinct structural region of the prokaryotic ubiquitin-like protein(Pup)is recognized by the N-terminal domain of the proteasomal A TPase M pa[J].FEBS Lett,2009,583(19)：3151-3157.

[14]Liao S,Shang Q,Zhang X,Zhang J,Xu C,Tu X.Pup,a prokary otic ubiquitin-like protein,is an intrinsically disordered protein[J].Biochem J,2009,422(2)：207-215.

[15]Burns KE,Pearce M J,Darwin KH.Prokaryotic ubiquitin-like protein provides a two-part degron to Mycobacterium proteasome substrates[J].J Bacteriol,2010,192(11)：2933-2935.

[16]Lin G,Tsu C,Dick L,Zhou XK,Nathan C.Distinct specificities ofMycobacterium tuberculosisand mammalian proteasomes for N-acetyl tripeptide substrates[J].J Biol Chem,2008,283(49)：34423-34431.

[17]Hu G,Lin G,Wang M,Dick L,Xu RM,Nathan C,Li H.Structure of theMycobacterium tuberculosisproteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate[J].Mol Microbiol,2006,59(5)：1417-1428.

[18]Li D,Li H,Wang T,Pan H,Lin G,Li H.Structural basis for the assembly and gate closure mechanisms of theMycobacterium tuberculosis20S proteasome[J].EMBO J,2010,29(12)：2037-2047.

[19]Mukherjee S,Orth K.Micrabiology.A protein pupylation paradigm[J].Science,2008,322(5904)：1062-1063.

[20]Pearce MJ,Mintseris J,Ferreyra J,Gygi SP,Darwin KM.Ubiquitin-like protein involved in the proteasome pathway ofMycobacterium tuberculosis[J].Science,2008,322(14)：1104-1107.

[21]Striebel F,Imkamp F,Sutter M,Steiner M,Mamedov A,Weber-Ban E.Bacterial ubiquitin-like modifier Pup is deamidated and conjugated to substrates by distinct but homologous enzymes[J].Nat Struct Mol Biol,2009,16(6)：647-651.

[22]Cerda-Maira FA,Pearce MJ,Fuortes M,Bishai WR,Hubbard SR,Darwin KH.Molecular analysis of the prokaryotic ubiquitin-like protein(Pup)conjugation pathway inMycobacterium tuberculosis[J].MolMicrobiol,2010,77(5)：1123-1135.

[23]Pearce M J,Arora P,Festa RA,Butler-Wu SM,Gokhale RS,Darwin KH.Identification of substrates of theMycobacterium tuberculosisproteasome[J].EMBO J,2006,25(22)：5423-5432.

[24]Imkamp F,Rosenberger T,Striebel F,Keller PM,Amstutz B,Sander P,Weber-Ban E.Deletion of dop in Mycobacterium smegmatis abolishes pupy lation of protein substratesin vivo[J].Mol Microbiol,2010,75(3)：744-754.

[25]Wang T,Li H,Lin G,T ang C,Li D,Nathan C,Darwin K H,Li H.Structural insights on theMycobacterium tuberc ulosisproteasomal ATPase Mpa[J].Structure,2009,17(10)：1377-1385.

[26]Salgame P.PUPylation provides the punch asMycobacterium tuberculosisbattles the host macrophage[J].Cell Host Microbe,2008,4(5)：415-416.

[27]Pieters J,Ploegh H.Microbiology.Chemical warfare and mycobacterialdefense[J].Science,2003,302(5652)：1900-1902.

[28]Gandotra S,Schnappinger D,Monteleone M,Hillen W,Ehrt S.In vivogene silencing identifies theMycobacterium tuberculosisproteasome as essential fo r the bacteria to persist in mice[J].Nat Med,2007,13(12)：1515-1520.

劉翠華(liucuihua@im.ac.cn)

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(30700975);中國科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新項(xiàng)目(KSCX2-EW-J-6和KSCX2-YW-R-164)

2010-10-13)

(本文編輯：郭萌 薛愛華)