陳永敢，陳光宙，袁學(xué)軍，陳忠蔭，林應(yīng)耀，林熾賢

（瓊州學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海南 三亞 572022）

靈芝 （Ganoderma spp.）是一種腐生型的真菌，以腐解木材中的木質(zhì)素作為生長發(fā)育的營養(yǎng)基礎(chǔ)。經(jīng)典分類學(xué)研究認(rèn)為，靈芝隸屬擔(dān)子菌門中的擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes）、 傘菌亞綱 （Agaricomycetidae）、 多孔菌目（Polyporales）、 靈 芝菌科 （Ganodermataceae）、 靈 芝 屬（Ganoderma）[1]。自古以來，靈芝就被認(rèn)為是滋補(bǔ)強(qiáng)壯的珍貴藥材，我國古代著名的醫(yī)學(xué)著作 《本草綱目》等就對其進(jìn)行了詳細(xì)的記載[2，3]。隨著近代生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的研究方法逐漸地運(yùn)用到靈芝功效研究中來，分析證明了靈芝中含有豐富的營養(yǎng)化學(xué)成分，且不同的物質(zhì)具有不同的臨床功效，最常見的有高分子多糖、三萜化合物、有機(jī)鍺、氨基酸、生物堿、蛋白酶及多種肽等，其中功能最顯著且研究最深入的是高分子多糖[4，5]。

通過熱水、CO2超臨界萃取技術(shù)，從靈芝中提取出來50多種高分子多糖[6]，這些多糖能抑制增生細(xì)胞的形成，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，可以想見在腫瘤生物學(xué)和病毒侵染等研究中這類化合物將發(fā)揮越來越重要的作用[7]。有研究表明，赤芝多糖有明顯的強(qiáng)心降壓作用，對動(dòng)脈粥樣硬化有預(yù)防和治療作用；靈芝子實(shí)體提取出2種聚糖（Ganoderan A、Ganoderan B），經(jīng)腹腔注入正常小鼠，均能降低血糖[8]。總之，隨著生物化學(xué)及分析化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，靈芝的功效將會(huì)越來越多的被揭示出來，同時(shí)其應(yīng)用前景將更加的廣泛。

近年來靈芝 （Ganoderma spp.）的人工栽培已有所推廣，特別是赤芝 （Ganoderma lucidum）的栽培技術(shù)已成熟，但人工栽培所必需的制種過程中，靈芝多糖含量變化的研究至今鮮有報(bào)道。本研究選取了4株具有重要藥用價(jià)值的靈芝，進(jìn)行栽培制種并研究其多糖含量的變化，對進(jìn)一步研究人工栽培靈芝藥用價(jià)值具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及靈芝的制種

供試菌株：Ganoderma atrum Hz2、Ganoderma lucidum Hz5、 Ganoderma neojaponicum Wzs1、 Ganoderma sinense Hz1四株菌株均為本研究室保存。

靈芝制種：靈芝菌絲接種于PDA培養(yǎng)基表面，于28℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，21 d后形成一級成熟菌絲。將一級成熟菌絲接種到二級培養(yǎng)基 （木屑78%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%、水，121℃、0.1 MPa滅菌2 h）上，28℃恒溫避光培養(yǎng)30 d得二級成熟菌絲；將二級成熟菌絲接種到三級培養(yǎng)基 （木屑73%、玉米粉5%、麥麩20%、蔗糖1%、石膏1%，121℃、0.1 MPa滅菌2 h）上，28℃恒溫避光培養(yǎng)50 d得三級成熟菌絲。

1.2 靈芝菌絲多糖待測液的制備

已培養(yǎng)成熟的靈芝菌絲65℃恒溫烘干，取0.2 g研磨粉碎并移至試管，加入15 mL 95%的酒精，密閉狀態(tài)下78℃水浴 30 min， 3 000 r·min－1離心 30 min， 去除上清，重復(fù)2次。取沉淀加入15 mL蒸餾水，密閉狀態(tài)下沸水浴1 h， 3 000 r·min－1離心 30 min。 收集上清并定容至 100 mL（菌株 Ganoderma neojaponicum Wzs1定容至 50 mL），搖勻得一級菌絲多糖待測液。二級菌絲上清液定容至50 mL（菌株Ganoderma lucidum Hz5定容至25 mL）、三級菌絲上清液均定容至25 mL，其它提取操作步驟與一級菌絲相同。

1.3 靈芝菌絲多糖含量的測定

適量葡萄糖105℃烘干并取0.5 g，蒸餾水溶解并定容至 50 mL， 從中取出 1 mL 定容至 50 mL， 得到 200 μg·mL－1的葡萄糖溶液，按表1制備葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.1 g蒽酮溶于106 mL硫酸溶液中 （硫酸溶液的配制為76 mL濃硫酸加30 mL水）。按表1取葡萄糖溶液和蒸餾水，加入5 mL蒽酮試劑搖勻，沸水浴10 min，再冰水浴10 min，625 nm處測定吸光值。取菌絲多糖待測液1 mL，加入蒽酮試劑5 mL，沸水浴10 min，之后冰水浴10 min，取出于625 nm處測定菌絲多糖溶液的吸光度。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備見表1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2 結(jié)果

2.1 靈芝的制種

將保存的菌株接種到一級培養(yǎng)基上培養(yǎng)21 d后，菌絲完全覆蓋培養(yǎng)基表面，菌絲純白、粗壯、致密，菌落中間略泛黃、，將菌絲轉(zhuǎn)接到二級種培養(yǎng)基，另挑取部分菌絲進(jìn)行烘干處理。菌絲在二級培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d菌絲長滿瓶，瓶蓋處菌絲厚實(shí)、純白。培養(yǎng)成熟的二級菌絲轉(zhuǎn)接到三級培養(yǎng)基，并挑取部分菌絲進(jìn)行烘干處理。菌絲在三級培養(yǎng)基上培養(yǎng)50 d長滿瓶，菌絲粗壯、密集、分布均勻，挑取成熟菌絲進(jìn)行烘干處理，見圖1。

2.2 制種過程中多糖含量的變化

以蒸餾水為空白，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

注：A表示吸光值，C表示葡萄糖濃度。

利用蒽酮－硫酸顯色法在波長為625 nm處，測得4株不同級種的靈芝菌絲吸光值在0.2～0.4之間。制種過程中靈芝菌絲多糖含量變化見圖2。

Hz2、Hz5、Hz1株靈芝真菌在制種過程中多糖含量呈遞減的趨勢，其中菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1較特殊，二級種在制種過程中多糖含量最多為1.75%。在制種的最初階段一級種時(shí)，4株靈芝真菌中Ganoderma sinense Hz1多糖含量最大為3.18%，而菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1最少為1.05%；處于完成制種的三級種階段，菌株Ganoderma lucidum Hz5多糖含量最少為0.56%，而菌株 Ganoderma atrum Hz2最大為 0.88%。

3 討論

靈芝真菌制種過程中，一級菌絲到三級菌絲多糖含量總體上呈遞減趨勢，其中一級菌絲到二級菌絲多糖含量的變化較大，二級菌絲到三級菌絲的多糖含量變化較小。一級PDA培養(yǎng)基主要成分為馬鈴薯、葡萄糖，而二級培養(yǎng)基與三級培養(yǎng)基相似，主要成分為木屑，這種成分上的差別可能造成了靈芝制種過程中多糖含量的遞減。二級與三級培養(yǎng)基含糖量較少，不利于菌絲對營養(yǎng)成分的吸收，同時(shí)菌絲在生長過程中消耗了菌體內(nèi)儲(chǔ)存的糖類物質(zhì)，因此在制種完成階段多糖的含量就比制種之初發(fā)生了減少[9]。菌株Ganoderma neojaponicum Wzs1分離自海南五指山，制種過程中各級菌絲多糖含量并未呈逐級遞減的規(guī)律性變化，二級種的含糖量明顯偏高，這種特殊性是產(chǎn)自五指山地區(qū)靈芝所具有的特點(diǎn)，還是Ganoderma neojaponicum本身具備的特征，有待進(jìn)一步的研究。

一級菌絲 Ganoderma atrum Hz2、Ganoderma sinense Hz1多糖含量較高，而Ganoderma lucidum Hz5多糖含量較低，這可能因?yàn)榍皟芍觎`芝菌絲都從野生子實(shí)體中分離出來的，未經(jīng)人工馴化保持了天然的多糖含量，而Hz5已經(jīng)經(jīng)過人工馴化。人工栽培的條件下，部分天然的糖分會(huì)有所丟失，所以Hz5一級菌絲多糖含量比菌株Hz2和Hz1的一級菌絲的多糖含量少[10]。在制種完成的三級種階段，4株菌株的多糖含量只有較小的差別，但菌株Hz5菌絲的多糖含量較少。因此，完成人工制種的紫芝和黑芝比赤芝的藥用價(jià)值高，實(shí)現(xiàn)這兩種靈芝的人工栽培將有利于進(jìn)一步推廣高品質(zhì)和高藥用價(jià)值的靈芝。

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