張 帆，王淑敏

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117）

大馬勃Calvatia gigantean(Batsch ex Pers)Lloyd為中藥馬勃的來(lái)源之一，具有止血、解毒、清肺、消腫、利喉等功效，可治療咳嗽、咽喉腫痛、扁桃體炎、外傷出血。由于野生資源不足，為擴(kuò)大藥源，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)大馬勃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初步研究，為液體深層發(fā)酵工藝研究以及規(guī)范化、工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)[1]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

大馬勃Calvatia gigantean(Batsch ex Pers)Lloyd斜面菌種，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥用真菌研究所提供。

1.2 藥品和試劑

葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、磷酸二氫鈉、維生素VB1、3,5-二硝基水楊酸試劑 （DNS）、鹽酸、氫氧化鈉，以上均為分析純，麥麩、豆餅粉、玉米粉。

1.3 試驗(yàn)儀器

HYG-III迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 （上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備成套廠）；721紫外可見分光光度計(jì) （上海第三分析儀器廠）；101-1A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠）；超凈工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備廠）；YXQGO-280手提式高壓蒸汽消毒器 （丹東市日用五金廠）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)及指標(biāo)測(cè)定

斜面菌種活化后，在無(wú)菌條件下，接入250 mL三角瓶 （培養(yǎng)基裝量100 mL）中，接種量為10%，在搖瓶機(jī)中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，搖瓶培養(yǎng)16 d，取出，過(guò)濾，將菌球烘干并稱其重量，發(fā)酵液則通過(guò)3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定其中多糖的含量。

1.4.2 碳源選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁20%、蛋白胨2%、KH2PO40.15%、MgSO40.10% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，碳源分別為空白、葡萄糖3%、蔗糖3%、玉米粉汁5%、乳糖3%、麥芽糖3%。每種培養(yǎng)基平行做3次，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.3 氮源選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁 20%、蔗糖3%、KH2PO40.15%、MgSO40.10% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，氮源分別為空白、蛋白胨2%、酵母膏0.5%、豆餅粉汁5%、黃豆粉汁3%、硝酸銨0.2%、麥麩汁5%、硫酸銨0.2%、牛糞汁5%，每種培養(yǎng)基平行做3次，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.4 微量元素選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏0.5% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，微量元素分別為空白；KH2PO40.15%；MgSO40.10%； KH2PO40.15%、 MgSO40.10%； CaO 0.1%、KH2PO40.15% 、 VB10.02% ； NaH2SO40.15% 、 KH2PO40.15%、 VB10.02%； VB10.02%。 每種培養(yǎng)基平行做 3次，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.5 不同營(yíng)養(yǎng)元素正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表

以馬鈴薯20% （pH自然）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)上述試驗(yàn)選擇的最佳碳源、氮源、微量元素進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析確定碳氮源及微量元素的最佳濃度組合。

1.4.6 發(fā)酵初始pH選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 將初始 pH 值調(diào)至 4、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、8.5、9.0。每種培養(yǎng)基平行做3個(gè)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.7 不同培養(yǎng)溫度選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 將液體培養(yǎng)基分別置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃下培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基平行做3個(gè)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.8 不同接種量選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 搖瓶接種量分別按3%、6%、10%、15%、20%比例接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基平行做3個(gè)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.4.9 不同搖瓶裝量選擇試驗(yàn)

以馬鈴薯汁20%、蔗糖3%、酵母膏 0.5%、MgSO40.1%、KH2PO40.15% （pH自然）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 在250 mL三角瓶中分別裝入60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基平行做3個(gè)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定[2－4]。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中，菌絲干重（g·100－1·mL－1）分別為 0.2016、 0.2634、 0.6497、 0.5473、0.2243、 0.2467； 多 糖 含 量 （ mg·mL－1）分 別 為 7.454、14.3651、 16.5481、 14.5628、 14.248、 14.2842。 結(jié)果表明，在供試5種碳源中，大馬勃菌絲能夠利用葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖、麥芽糖，其菌絲長(zhǎng)勢(shì)和初級(jí)代謝產(chǎn)物多糖的含量以蔗糖為碳源時(shí)最佳；以葡萄糖、玉米粉、麥芽糖為碳源時(shí)較好；以乳糖為碳源時(shí)較差，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較弱，多糖含量也較低。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)和初級(jí)代謝產(chǎn)物多糖的含量來(lái)看，不同碳源順序?yàn)檎崽牵居衩字酒咸烟牵钧溠刻牵救樘?，因此蔗糖為最佳碳源?/p>

2.2 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中，菌絲干重（g·100－1·mL－1）分別為 0.5010、 0.6147、 0.6356、 0.5637、0.4829、 0.4743、 0.5832、 0.5013、 0.5459； 多糖含量 （mg·mL－1）分 別 為 14.4655、 15.053、 15.9805、 14.2482、 13.4249、11.858、 14.8007、 14.114、 12.8506。 結(jié)果表明， 在供試 8種氮源中，大馬勃菌絲能夠利用蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、黃豆粉、麥麩汁、硝酸銨、硫酸銨、牛糞汁。在酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳，多糖含量最高；當(dāng)?shù)词堑鞍纂撕望滬熤瓡r(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，多糖含量接近；當(dāng)?shù)礊槠渌麜r(shí)，菌絲生長(zhǎng)較緩慢，多糖代謝也較少。不同氮源順序?yàn)榻湍父啵镜鞍纂耍钧滬熤径癸灧郏九＜S汁＞黃豆粉＞硫酸銨＞硝酸銨，酵母膏為大馬勃菌株的最佳氮源。

2.3 不同微量元素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同微量元素對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中，菌絲干 重 （g·100－1·mL－1）分 別 為 0.4006、 0.4647、 0.4372、0.5734、 0.4145、 0.4562、 0.5441； 多糖含量 （mg·mL－1）分別 為 10.1642、 13.062、 11.804、 14.5275、 10.4514、13.439、14.2018。結(jié)果表明，在供試6種微量元素中，大馬勃菌絲能夠利用各種微量元素生長(zhǎng)。在KH2PO4、MgSO4為微量元素的培養(yǎng)基中，菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳，多糖含量也最高；當(dāng)微量元素是VB1和 NaH2PO4、KH2PO4、VB1時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，多糖含量接近；當(dāng)微量元素為其他時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較緩慢，多糖代謝也較少。不同微量元素培養(yǎng)基的順序 為 KH2PO4、 MgSO4＞VB1＞ NaH2PO4、 KH2PO4、 VB1＞KH2PO4＞ MgSO4＞ CaO、 KH2PO4、 VB1。 KH2PO4、 MgSO4為大馬勃菌株的最佳微量元素。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果碳源選擇蔗糖，氮源選擇酵母膏，微量元素選擇KH2PO4、MgSO4，進(jìn)行正交試驗(yàn)考察，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

通過(guò)方差分析表可知，各因素沒有顯著性差異，改用直觀分析，結(jié)果可得最佳培養(yǎng)基組合為蔗糖3%、酵母膏0.75%、 KH2PO40.15%、 MgSO40.1%。

2.5 不同pH試驗(yàn)結(jié)果

不同初始pH對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中，菌絲干 重 （g·100－1·mL－1）分 別 為 0.4210、 0.4778、 0.5024、0.5913、 0.5721、 0.5046、 0.5127、 0.4130、 0.3837； 多糖含量 （ mg·mL－1）分 別 為 15.027、 15.3310、 15.1031、16.2793、 15.8917、 15.0239、 15.5714、 14.9335、 14.4096。結(jié)果表明，當(dāng)pH值小于5.0或大于9時(shí)，大馬勃菌絲不能生長(zhǎng)；當(dāng)pH值為6.5時(shí)，菌絲生物量達(dá)到最大值。當(dāng)發(fā)酵初始pH值超過(guò)6.5時(shí)，隨著pH值的升高，菌絲生物量逐步降低。因此發(fā)酵初始pH值6.5為大馬勃液體發(fā)酵最適pH值。

表2 不同營(yíng)養(yǎng)元素的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 不同培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果

不同培養(yǎng)溫度對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中，菌絲干 重 （g·100－1·mL－1）分 別 為 0.3004、 0.4367、 0.4750、0.5299、 0.4349； 多 糖 含 量 （mg·mL－1）分 別 為 10.2762、10.3095、 12.1147、 14.596、 12.7008。 結(jié)果表明 ， 隨著培養(yǎng)溫度的不斷升高，菌絲生物量不斷增加，當(dāng)溫度達(dá)到28℃時(shí)，菌絲生物量和代謝指標(biāo)多糖含量達(dá)到最大，但當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)增高時(shí)，菌絲生物量不再增加，反而降低。可見培養(yǎng)溫度為28℃為大馬勃液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)溫度。

2.7 不同接種量試驗(yàn)結(jié)果

不同接種量對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中菌絲干重（g·100－1·mL－1）分 別 為 0.237、 0.3064、 0.4796、 0.4249、0.443； 多 糖 含 量 （ mg·mL－1）分 別 為 8.459、 9.3712、12.0073、 11.809、 11.9136。 結(jié)果表明， 從菌絲生長(zhǎng)發(fā)育速度、菌球干重及代謝指標(biāo)多糖含量進(jìn)行比較，接種量3%～6%菌絲生長(zhǎng)發(fā)育速度慢、菌絲干重低、多糖含量少；接種量15%～20%與10%各項(xiàng)指標(biāo)基本一致，未見明顯差異，考慮接種量過(guò)大，浪費(fèi)菌種，提高成本。因此以10%左右為宜。

2.8 不同搖瓶裝量試驗(yàn)結(jié)果

不同搖瓶裝量對(duì)大馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響指標(biāo)中菌絲干重 （ g·100－1·mL－1）分 別 為 0.2017、 0.3196、 0.3980、0.3714、 0.2914； 多 糖 含 量 （mg·mL－1）分 別 為 9.325、10.2071、 12.389、 12.906、 12.7834。 當(dāng)搖瓶中培養(yǎng)基裝量過(guò)少時(shí)，雖然溶氧量高，但搖瓶?jī)?nèi)菌絲生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)供給量不足，影響菌絲生長(zhǎng)而導(dǎo)致菌絲生物量??；當(dāng)搖瓶中培養(yǎng)基裝液量大于100 mL時(shí)，由于溶氧量少，同樣不利于菌絲生長(zhǎng)，影響菌絲生物量。因此，250 mL三角瓶中裝液量在100 mL左右較為合適，菌絲生物量最高。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)大馬勃液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行初步篩選，確定最佳液體培養(yǎng)基為馬鈴薯20%、蔗糖3%、酵母膏 0.75%、 KH2PO40.15%、 MgSO40.1% （pH 自然）； 培養(yǎng)條件為pH值6.5，溫度28℃，接種量10%，搖瓶裝量250 mL錐形三角形100 mL。為液體深層發(fā)酵工藝研究以及規(guī)范化、工廠化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

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