張雪玲 齊曉嵐 單可人 官志忠

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，是一種主要在老年期發(fā)生的以認(rèn)知能力緩慢性進(jìn)行性喪失為主要特征的神經(jīng)退變性疾病。病理學(xué)上以細(xì)胞外老年斑(SPs)形成及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)為主要特征〔1～3〕。SPs的主要成分為β-淀粉樣蛋白(Aβ)，是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以引起神經(jīng)元的損傷和死亡，在 AD的發(fā)病中起著重要的作用。β-分泌酶(BACE)是啟動(dòng)Aβ形成的關(guān)鍵限速酶。因此，BACE有望成為治療AD的作用靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)治療AD的提供了一條新思路〔4〕。神經(jīng)型尼古丁受體(nAChR)與大腦學(xué)習(xí)記憶、智力發(fā)育和識(shí)別能力等腦功能有關(guān)，還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕，在AD的發(fā)病中起著重要的作用。本課題組前期研究表明α3 nAChR具有一定的對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性作用，在AD的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用〔6〕，但其具體機(jī)制是否與Aβ生成密切相關(guān)的BACE有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。本研究觀察α3 nAChR是否通過(guò)影響B(tài)ACE蛋白表達(dá)從而減少Aβ的神經(jīng)毒性作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備 D-MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco Invitrogen公司(英國(guó));G418購(gòu)自Sigma公司;普通化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司;源于人腦的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y細(xì)胞)購(gòu)于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司(德國(guó));穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR siRNA表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞本課題組于2008年凍存于本實(shí)驗(yàn)室液氮罐中;羊抗BACE1及BACE2、鼠抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗羊及抗鼠二抗購(gòu)自Santa Cruz公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞為貼壁細(xì)胞。用含15%小牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的DMEM作為培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染 α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒Negative control pSilencer 3.1-H1 neo的空質(zhì)粒對(duì)照組，還需用含 0.4 mg/ml G418的培養(yǎng)液篩選，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR基因沉默效果測(cè)定 采用Trizol(Invitrogen)一步法提取細(xì)胞總RNA。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行Real-time PCR。所用試劑為 TaqMan Universal 2 ×PCR Mix，α3 nAChR(Hs01088199_m1)和內(nèi)對(duì)照β-actin(4352935E)Taqman探針購(gòu)自Applied Biosystems公司，ABI7300型熒光定量PCR儀采集待測(cè)基因及內(nèi)參照 β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，以 Applied Biosystems SDS1.4軟件進(jìn)行熒光采集和數(shù)據(jù)分析。SDS1.4軟件分析其△△Ct值及 RQ(relative quantity)值，RQ=2-△△Ct。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算轉(zhuǎn)染α3 nAChR pSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組及空質(zhì)粒對(duì)照組間α3 nAChR mRNA和對(duì)照組的相對(duì)水平。用蛋白印跡方法檢測(cè)α3 nAChR蛋白表達(dá)水平。重復(fù)三次。

1.2.3 BACE蛋白表達(dá)水平測(cè)定 參照Guan等〔7〕的方法進(jìn)行提取細(xì)胞蛋白并定量，加磷酸鹽緩沖液(PBS，4℃預(yù)冷)洗滌一次后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞入1.5 ml無(wú)菌離心管中，再用PBS洗滌一次加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)和復(fù)合蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液約40～60μl，置于冰上1 h，其間不時(shí)置于漩渦混勻器，使細(xì)胞充分裂解;12 000 r/min，4℃，離心40 min;小心吸取上清液至另一發(fā)泡聚丙烯(EPP)管;對(duì)上述制備的上清液進(jìn)行蛋白定量后分裝，－20℃保存?zhèn)溆?用蛋白印跡方法檢測(cè)BACE1，BACE2蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所得結(jié)果用x±s表示，兩因素析采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒細(xì)胞株mRNA及蛋白表達(dá)水平 用Real-time RT-PCR及Western印跡方法檢測(cè)到SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒后mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與正常對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性。見(jiàn)表1，圖1。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒細(xì)胞株α3 nAChR蛋白表達(dá)

2.2 α3 nAChR基因表達(dá)沉默對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞BACE蛋白表達(dá)水平的影響 SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR基因表達(dá)沉默后，細(xì)胞BACE 1蛋白表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)，BACE 2蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.01)。見(jiàn)表2，圖2。

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒細(xì)胞株BACE1及BACE2蛋白表達(dá)

表1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒細(xì)胞株α3 nAChR mRNA及蛋白表達(dá)(x ± s，n=3)

表2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR PSilencer 3.1-H1 neo質(zhì)粒細(xì)胞株BACE1、BACE2蛋白表達(dá)水平(x ± s，n=3)

3 討論

nAChR是一類明確的具有神經(jīng)保護(hù)功能的受體，與大腦學(xué)習(xí)記憶、智力發(fā)育和識(shí)別能力等腦功能有關(guān)，還調(diào)節(jié)多種受體的功能，并具有對(duì)抗細(xì)胞毒性神經(jīng)保護(hù)作用，其含量減少與AD的發(fā)生有關(guān)，在SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中α3是主要的尼古丁受體亞類之一，與AD的發(fā)病有關(guān)。但α3 nAChR對(duì)與Aβ生成密切相關(guān)的BACE的蛋白表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。Aβ是由其APP經(jīng)β-和γ-分泌酶水解后而形成，具有一定的神經(jīng)毒性作用，可以引起神經(jīng)元的損傷和死亡，只有完整的Aβ才能發(fā)揮神經(jīng)毒性作用。BACE是啟動(dòng)Aβ形成的關(guān)鍵限速酶，有兩個(gè)亞型即BACE1和BACE2。BACE1是具有BACE活性的天門(mén)冬氨酸蛋白酶，俗稱BACE1或BACE。研究表明純化的BACE1蛋白的確在BACE的作用位點(diǎn)進(jìn)行切割〔8〕，從而增加神經(jīng)毒性物質(zhì)Aβ的生成。在發(fā)現(xiàn) BACE1不久，發(fā)現(xiàn)了其同源蛋白稱為BACE2。研究表明，BACE2雖能在BACE位點(diǎn)裂解APP，但它在Aβ結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的裂解更有效，因此BACE2可抑制神經(jīng)毒性物質(zhì)的Aβ生成〔9〕。本課題組前期研究顯示α3 nAChR具有一定對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性作用，其是否與β分泌酶有關(guān)未見(jiàn)報(bào)道。本課題組構(gòu)建了SH-SY5Y細(xì)胞α3 nAChR siRNA真核表達(dá)載體，并且有效地表達(dá)了針對(duì)α3 nAChR的siRNA，將其轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)和蛋白印跡方法分別對(duì)α3尼古丁受體基因mRNA和蛋白水平進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，由siRNA介導(dǎo)沉默后α3尼古丁受體基因的表達(dá)及蛋白的表達(dá)均明顯下降，且下降程度基本一致。結(jié)果表明小分子干擾RNA能有效地抑制內(nèi)源性α3 nAChR基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α3 nAChR siRNA表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞克隆株，與空質(zhì)粒及正常對(duì)照組相比BACE1蛋白表達(dá)水平增加，BACE2蛋白表達(dá)水平減少，表明α3 nAChR能夠增加BACE2蛋白表達(dá)水平及減少BACE1蛋白表達(dá)水平而影響Aβ的生成從而對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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6 唐 智，齊曉嵐，單可人，等.SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中尼古丁受體α3亞單位基因表達(dá)抑制與APP代謝的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(21):2749-51.

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