莊秋紅 李 譞 趙學忠

(吉林省武警總隊醫(yī)院，吉林 長春 130062)

血管平滑肌細胞(VSMC)是構成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡的失衡可以導致動脈粥樣硬化(AS)和PCI術后管腔再狹窄。有研究證明鈣通道阻滯劑(CCB)類藥物有抗AS作用。鹽酸地爾硫艸卓(合貝爽)是CCB中地爾硫艸卓類藥物，本實驗應用合貝爽抑制血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的VSMC增殖，并觀察其對凋亡基因的影響，旨在探討合貝爽有無抗AS作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)、鑒定及分組 清潔級Wistar大鼠在無菌操作條件下取胸主動脈中層加入RPMI1640培養(yǎng)液，采用貼塊法培養(yǎng)，放入CO2孵箱培養(yǎng)，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待單層細胞生長近培養(yǎng)瓶底80%以上時可傳代。實驗中采用4～6代VSMC。采用兔抗大鼠平滑肌肌動蛋白(α-SMA)對動脈平滑肌細胞進行肌動蛋白免疫組化染色，鑒定其是否為VSMC。

將 4～6代 VSMC隨機分為空白組、模型組(AngⅡ10－7mol/L)、模型 +合貝爽1組(合貝爽10－5mol/L)、模型 +合貝爽2組(合貝爽10－6mol/L)、模型+合貝爽3組(合貝爽10－7mol/L)，以上各組培養(yǎng)48 h。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖能力測定 采用MTT法檢測VSMC的生長率，各組細胞加入MTT溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，加入二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值。

1.2.2 原位細胞凋亡染色 各組細胞爬片用40% 多聚甲醛室溫固定30 min，放入0.3%H2O－2甲醇中30 min封閉，放入0.1%TritonX-100枸櫞酸鈉緩沖液中冰浴2 min，加25μl的TUNEL反應混合液，在濕盒中37℃反應60 min，加25μl轉化劑，在濕盒中37℃孵育30 min，加入DAB底物溶液，室溫孵育10 ～30 min，復染核，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.3 RT-PCR 法檢測細胞內 Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表達情況

1.2.3.1 各組VSMC中總RNA提取 VSMC中加入1 ml Trizol試劑，輕輕搖動至細胞裂解、液體變黏，加入0.2 ml氯仿，離心后取上層水相加入0.5 ml異丙醇，室溫下放置10 min后混勻，離心后沉淀中加入75%乙醇1 ml洗滌1次，離心后沉淀干燥10 min，沉淀重懸于DEPC水中。

1.2.3.2 反應體系及循環(huán)參數(shù) (1)總RNA逆轉錄反應:等量取上述每個標本總RNA 1μg，分別逆轉錄成cDNA。反應體系(20 μl):RNA 10 μl、Oligo dT 1 μl，90℃水浴5 min，置于冰上2 min，后續(xù)加 M-MLV 1 μl、dNTP 2 μl、RNase抑制劑0.5 μl、雙蒸水 5.5 μl，42℃水浴 60 min，95℃水浴 5 min，置于 4℃保存。(2)PCR反應體系(50μl)10×PCR緩沖液5μl、MgCl25μl、dNTP 1μl、目的基因上游、下游引物各1 μl、Tap DNA 酶1 μl、樣本cDNA 2μl、重蒸水32μl。反應條件:95℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸 60 s，循環(huán)30次。

1.2.3.3 電泳分離、結果測定 取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外分析儀下觀察，并拍照記錄結果，每份樣品的GAPDH擴增帶均應陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析 各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用樣本均數(shù)的方差分析。

2 結果

2.1 VSMC的鑒定 采用α-SMA免疫組化染色，結果顯示＞98%的細胞染色呈陽性，即細胞質內呈棕黃色反應，胞核不著色，表明細胞含有肌動蛋白，證實為VSMC。見圖1。

2.2 合貝爽對VSMC增殖能力的影響 模型組生長率比空白組明顯升高，兩者存在顯著差異(P＜0.05)，提示AngⅡ促進VSMC增殖;合貝爽1、2、3組生長率均比模型組顯著降低，有顯著差異(P＜0.05)，并與劑量相關，提示合貝爽有抑制AngⅡ促進的VSMC增殖的作用。見表1。

2.3 合貝爽對VSMC凋亡的影響 TUNEL染色陽性細胞表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色著色，細胞質不著色。在400倍顯微鏡下計數(shù)陽性細胞的個數(shù)，陽性細胞數(shù)/視野內細胞總數(shù)即為凋亡率。合貝爽1、2、3組凋亡率比模型組增高，有顯著差異(P＜0.05)，并與劑量相關，提示合貝爽有促進VSMC凋亡的作用。見表1。

2.4 合貝爽對 VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53基因表達的影響合貝爽1、2、3組Bcl-2 mRNA的表達量比模型組減少，有顯著差異(P＜0.05)，說明合貝爽對Bcl-2的表達有抑制作用。合貝爽1、2、3組Bax、Fas mRNA的表達量比模型組增多，有顯著差異(P＜0.05)，說明合貝爽對Bax、Fas的表達有促進作用。合貝爽1、2組P53 mRNA的表達量比模型組增多，合貝爽3組P53 mRNA的表達量與模型組比較無統(tǒng)計學意義，說明合貝爽對P53的表達有促進作用。見表2和圖2。

表1 不同濃度合貝爽對AngⅡ誘導的VSMC增殖及凋亡率的影響(x ± s，n=8)

表2 各組VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA的表達情況(x ± s，n=3)

圖1 VSMCα-SMA免疫組化染色(×200)

圖2 各組 VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表達

3 討論

VSMC是構成血管壁的重要成分，其過度增殖、凋亡減少是動脈粥樣硬化(AS)和PCI術后管腔再狹窄形成的重要步驟〔1〕。因此開發(fā)安全有效的促進VSMC凋亡、抑制增殖的藥物具有重要臨床意義。合貝爽(herbesser)通用名為地爾硫艸卓，主要作用為抑制平滑肌細胞收縮，擴張冠狀動脈，用于治療不穩(wěn)定型心絞痛。本實驗結果顯示合貝爽能使VSMC生長率降低，凋亡率增加，說明合貝爽可能有抑制VSMC的增殖、促進VSMC凋亡的作用。

本實驗顯示合貝爽抑制抗凋亡Bcl-2的表達，促進促凋亡基因Bax、Fas、P53的表達。Bcl-2是抗凋亡基因，通過阻止線粒體膜上通透性孔道的開放，阻止線粒體細胞色素C的釋放，抑制caspase-9的激活;中和促進凋亡的蛋白和引起細胞核谷胱苷肽(GSH)積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低caspase的活性，最終抑制 VSMC 的凋亡〔2〕。Bax、Fas、P53 是促凋亡基因，通過激活線粒體途徑和死亡受體途徑，最終導致VSMC凋亡的發(fā)生。Bax在細胞內超表達，形成同源二聚體多，Bax與Bcl-2形成異源二聚體減少，與Bax分離的Bcl-2增多，使Bcl-2失去了抗凋亡能力，細胞對死亡信號的反應增強〔3〕。P53是Bax的正調因子、Bcl-2的負調因子，Bcl-2/Bax的減少使細胞色素C從線粒體中釋放出來，近而導致快速的caspase級聯(lián)反應，最后導致線粒體介導的細胞凋亡〔4〕。P53還可以改變死亡受體的分布，使其由細胞質轉移到細胞表面，增加細胞對死亡受體介導的細胞凋亡的敏感性〔5〕。Fas是死亡受體家族的重要成員，F(xiàn)as與Fas配體蛋白在細胞膜上結合后，觸發(fā)自身三聚化，激活caspase-3，caspase-3水解多種蛋白如內源性DNA酶、細胞骨架成分，最終引發(fā)細胞凋亡〔6〕。

綜上所述，合貝爽可能通過抑制抗凋亡基因Bcl-2表達，促進促凋亡基因Bax、Fas和P53表達，使VSMC凋亡增加，抑制VSMC增殖。VSMC增殖減少使血管壁細胞數(shù)量減少、內膜變薄、管腔狹窄減輕，減少了細胞因子的釋放和基質降解酶和促血栓分子的表達，延緩或逆轉了AS的發(fā)展〔7〕。VSMC增殖的減少延緩了其向內膜下遷移，減少了細胞外基質的合成，防治了PCI術后再狹窄的發(fā)生〔8〕。

1 Rose R.Atherosolereosis-an inflammatory disease〔J〕.N Eng J Med，1999;340(2):115-26.

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3 Schendel SL，Xie ZH，Montal MO，et al.Channel formation by anti-apoptotic protein Bcl-2〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;13:1899-911.

4 vanden Abeele F，Skryma R，Shuba Y，et al.Bcl-2-dependent modulation Ca2+homeostasis and store-operated channels in prostate cancer cells〔J〕.Cancer Cell，2002;1(2):169-79.

5 Wu GS，Burns TF，McDonald ER，et al.KILLER/DR5 is a DNA damageinducible P53-regulated death receptor gene〔J〕.Nat Genet，1997;17(2):141-3.

6 Chan SW，Hegyi L，Scott S，et al.Sensitivity to Fas-mediated apoptosis is determined below receptor level in human vascular smooth muscle cells〔J〕.Circ Res，2000;86:1038-52.

7 Rivaed A，Andres V.Vascular smooth muscle cell proliferation in the pathogenesis of atherosclerotic cardiovascular diseases〔J〕.Histol Histopathol，2000;16:557-71.

8 Ross R，Glomset JA.The pathogenesis of atherosclerosis〔J〕.N Engl J Med，1996;295:420-5.