王柏欣 王 昕 邱洪斌 王淑秋 陳 梅 王景濤 徐 輝 陳廷玉

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

他汀類藥物是新一代調(diào)脂藥，可競爭性抑制膽固醇合成酶系中的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，使膽固醇合成受到限制。辛伐他汀為半合成他汀類藥物，在缺血性卒中、多發(fā)性硬化、Alzheimer病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有廣泛神經(jīng)保護(hù)作用〔1～3〕。本實驗采用大鼠局灶性腦缺血模型，觀察辛伐他汀對大鼠腦缺血損傷后細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康成年Wistar大鼠，250～300 g，隨機(jī)分為四組，空白對照組，假手術(shù)組，模型組，辛伐他汀組。模型組和辛伐他汀組都應(yīng)用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，模型組根據(jù)再灌注時間分為1，2，3，5，7 d。辛伐他汀組也根據(jù)用藥時間再分為用藥 1，2，3，5，7 d。

1.2 試劑 辛伐他汀(浙江京新藥業(yè)股份有限公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(In situ cell apoptosis Detection kit I，POD)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立腦缺血再灌注模型 根據(jù)Longa法〔4〕大腦中動脈栓塞法制備腦缺血再灌注模型。動物稱重，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定(上門齒、四肢遠(yuǎn)端用粗線固定于鼠板上)，碘伏消毒頸部皮膚，頸部正中切口，分離出頸總動脈、頸外動脈以及頸內(nèi)動脈，分別接扎頸總動脈及頸外動脈，在頸總動脈距離分叉處將尼龍線導(dǎo)入頸內(nèi)動脈，插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm，感到輕微阻力時立即停止插線。此后縫合傷口，留置線頭于體外，30 min后將線拴提至頸總動脈內(nèi)，完成再灌注。術(shù)后將室溫控制在25℃ ～30℃，視動物狀況注射呋塞米或抗生素預(yù)防腦水腫和感染。假手術(shù)組除進(jìn)線1.5 mm外，其余相同。辛伐他汀組模型制作成功后，在術(shù)后第1天開始給藥。

1.3.2 大鼠神經(jīng)功能Zea-longa評分〔4〕無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動正常者，計0分;不能完全伸展對側(cè)前爪，計1分;動物爬行時出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)，計2分;身體向偏癱側(cè)傾倒者，計3分;不能自發(fā)行走，意識喪失者，計4分。評分為0分和4分者均被剔除，神經(jīng)功能評價在取材前進(jìn)行。

1.3.3 組織切片的制備 各組實驗結(jié)束點(diǎn)將動物麻醉，經(jīng)左心室插管快速灌注生理鹽水約250 ml進(jìn)行心臟灌洗，用4%多聚甲醛灌洗固定，迅速斷頭取腦，于視交叉后冠狀切取3 mm厚度組織塊，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)改變，神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色法，觀察細(xì)胞凋亡情況:切片常規(guī)脫蠟入水，按照試劑盒說明書操作，DAB顯色10～30 min，水洗，蘇木素輕度復(fù)染，水洗，脫水，透明，封片。光鏡下觀察正常細(xì)胞核被染成藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色。凋亡細(xì)胞計數(shù)方法:選取腦皮層部位，200倍光鏡下計數(shù)5個視野陽性細(xì)胞數(shù)目，求其平均值。

1.3.4 電鏡法 各組動物大腦皮層部位腦組織，常規(guī)透射電鏡樣品制備(鋨酸后固定2 h，0.1 mmol PBS漂洗，50%、70%、80%、90%、100%、乙醇逐級脫水，純丙酮置換，Epon812包埋，60℃聚合48 h，超薄切片經(jīng)鈾-鉛雙染)，使用電鏡對大腦皮層腦組織進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以x±s表示。不同時點(diǎn)間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 空白對照組(即正常組)形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常，假手術(shù)組染色深，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)無異常。模型組，隨著再灌注時間的不同出現(xiàn)不同程度細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，胞體和胞核固縮，深染，核仁不清楚，甚至出現(xiàn)神經(jīng)元核破裂。辛伐他汀組也出現(xiàn)不同程度細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，胞體和胞核固縮甚至核破裂，但是相對于模型組同時間比較數(shù)量減少，程度較弱，以3 d最顯著。見圖1。

2.2 電鏡法檢測結(jié)果 假手術(shù)組腦細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，核膜完整，核孔清晰可見，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好。模型組與假手術(shù)組相比線粒體數(shù)量減少，部分線粒體嵴減少，板層小體數(shù)目減少，排空增多。辛伐他汀組可以減輕此種情況，線粒體呈圓形或卵圓形，嵴較清楚，微絨毛較完整，板層小體結(jié)構(gòu)較完整，僅出現(xiàn)少量的線粒體空泡。見圖2。

2.3 TUNEL法檢測結(jié)果 空白對照組(即正常組)未見凋亡細(xì)胞，假手術(shù)組僅有零星凋亡細(xì)胞，模型組與辛伐他汀組各亞組在缺血再灌注1 d后凋亡細(xì)胞開始升高，在3 d達(dá)到高峰，隨后下降;辛伐他汀組與模型組在相同時間點(diǎn)組間比較，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。以第3天表現(xiàn)最顯著，見表1、圖3。

表1 辛伐他汀對大鼠局部腦缺血再灌注不同時點(diǎn)腦細(xì)胞凋亡的影響(x±s，n=6，個/200 倍視野)

圖1 HE染色觀察各組神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變(×200)

圖2 電鏡下觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖3 TUNEL法觀察各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(×200)

3 討論

缺血性腦血管病(ICVD)在腦血管病中最為常見，在我國因其具有發(fā)病率上升及發(fā)病年齡的年輕化趨勢而日益受到醫(yī)學(xué)界的重視〔5〕。近年的研究表明，細(xì)胞凋亡是腦缺血病理作用的重要環(huán)節(jié)，是造成腦缺血后繼發(fā)性損害的重要機(jī)制〔5，6〕，腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損害的分子機(jī)制迄今尚未完全被闡明。腦缺血后神經(jīng)元的死亡主要表現(xiàn)為壞死和凋亡兩種形式。細(xì)胞凋亡是在生理和病理條件下的一種主動的死亡方式，受細(xì)胞內(nèi)、外因子調(diào)控。在腦缺血再灌注的中心區(qū)，由于血液供給急劇減少，細(xì)胞能量供給缺乏，ATP耗竭，Na+/K+泵衰竭，導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞腫脹，壞死;而在缺血半暗帶區(qū)由于有側(cè)支循環(huán)供血，缺血程度較缺血中心區(qū)輕，存在部分能量供應(yīng)，則細(xì)胞損害相對較輕而進(jìn)展慢;“再灌注損傷”可產(chǎn)生鈣離子失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體功能異常，過氧化作用增強(qiáng)等，這些均可以導(dǎo)致DNA損傷，后者如不能及時修復(fù)，積累到一定程度，則可通過啟動凋亡程序，引起細(xì)胞凋亡，并隨再灌注時間延長，DNA損傷積累，凋亡細(xì)胞亦不斷增加〔7〕。目前認(rèn)為，凋亡在腦缺血-再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，并且對梗死的形成過程有著重要的影響。近來的研究表明，辛伐他汀具有多向性神經(jīng)保護(hù)功能〔8〕，能降低腦卒中的發(fā)病率并減輕再灌注損傷〔9〕，但其機(jī)制尚未明了。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成缺血-再灌注損傷的重要因素，凋亡神經(jīng)細(xì)胞的多少決定著腦損傷最終范圍的大小〔10〕，因此，防治細(xì)胞凋亡是減輕再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。本實驗結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，經(jīng)過辛伐他汀治療后，細(xì)胞凋亡數(shù)目和程度明顯降低，說明辛伐他汀具有一定的抑制凋亡的作用，并可能通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而保護(hù)大鼠腦缺血再灌注所致的損傷，但其抑制凋亡的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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