侯 澍 張 磊 李紅杰 胡林森

(首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038)

神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)之一，它掌控著神經(jīng)元的生存、分化、生長發(fā)育、凋亡等重要生理功能，也參與受損神經(jīng)的再生和功能修復〔1〕。本研究在建立NGF誘導PC12細胞分化模型的基礎上，應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選NGF誘導PC12細胞分化過程的結(jié)構(gòu)相關蛋白，探索細胞形態(tài)變化的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM購自Gibco公司。神經(jīng)生長因子購自廈門北大之路生物工程有限公司。CyDye熒光標記物、24 cm固相pH梯度干膠條、胰蛋白酶、Clean-up試劑盒、2D Quant定量試劑盒等均購自GE Healthcare-Biosciences公司。谷氨酰胺、hACTH(19～39)和AngⅢ均購自美國Sigma公司。倒置相差熒光顯微鏡為日本O-lympus產(chǎn)品;蛋白質(zhì)組學設備由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF誘導PC12細胞分化模型的建立 PC12細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%新生牛血清、1%谷氨酰胺)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將同一批細胞分為實驗組和對照組，按1×105個/ml密度接種，培養(yǎng)24 h后，在實驗組中加入50 ng/ml NGF，而在對照組中加入等體積培養(yǎng)液。給藥后分別于0、6、96 h進行吖啶橙和溴化乙啶染色，之后觀察細胞形態(tài)的變化。

1.3 蛋白質(zhì)組學分析 選取四批不同代數(shù)的細胞，培養(yǎng)24 h后，實驗組加入NGF、對照組中加入培養(yǎng)液，再培養(yǎng)6 h或96 h。小心刮取細胞，2 000 r/min、4℃離心5 min，向沉淀中加入細胞裂解液，19 500 r/min、室溫離心30 min，取上清。應用Clean-up試劑盒去除樣品雜質(zhì)，2D Quant定量試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。分別以1μl CyDye(Cy3、5)工作液標記相應的蛋白樣品，用4μl Cy2工作液標記內(nèi)標，冰浴避光30 min。按照蛋白質(zhì)組學的操作說明，將3種熒光標記的樣品混合在一起，上樣至相應膠槽中，固相pH梯度干膠條放入膠槽，然后置于Ettan IPGphorⅡ等電聚焦電泳儀上，按自動程序進行水化與等電聚焦。經(jīng)2次平衡，將IPG膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE膠上端，進行電泳。用Typhoon 9400激光掃描儀進行掃描，用DeCyder差異分析軟件，找出蛋白表達差異點。

1.4 差異蛋白點的鑒定 從實驗組和對照組中各取600μg蛋白，上述同樣方法進行制備膠的制作，考馬斯亮藍染色。切取與差異表達點相匹配的蛋白點，用20 ng/μl胰蛋白酶將蛋白點于37℃酶切2 h。樣品與等體積基質(zhì)混勻后進行點樣，將MALDI-TOF質(zhì)譜儀所測的肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)輸入NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索。

2 結(jié)果

2.1 NGF作用下PC12細胞形態(tài)學變化 光鏡下動態(tài)觀察NGF作用下PC12細胞的形態(tài)學變化，對照組大多數(shù)PC12細胞呈圓形，散在生長或聚團生長，為未分化細胞(圖1A);而在NGF作用6 h以后細胞開始長出神經(jīng)突起(圖1B);至96 h時細胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，48%的細胞長出長突起，不同細胞的突起可連接成網(wǎng)(圖1C)。

圖1 對照組與NGF處理組PC12細胞的形態(tài)(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

圖2 NGF誘導PC12細胞分化晚期MALDI-TOF MS鑒定的細胞結(jié)構(gòu)蛋白

2.2 NGF誘導6 h和96 h細胞差異表達的結(jié)構(gòu)蛋白50 ng/ml NGF作用于PC12細胞6 h，提取全細胞蛋白，與對照組比較，質(zhì)譜鑒定后，沒有差異表達的結(jié)構(gòu)蛋白被鑒定出來。

而用DeCyder BVA軟件分析NGF誘導PC12細胞分化晚期(96 h)的細胞蛋白質(zhì)表達量差異，并進行蛋白質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)5種表達增高的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，在雙向膠上分布見圖2A，其中點A為神經(jīng)絲蛋白-M(NF-M)，點B是神經(jīng)絲蛋白-L(NF-L)，點C為微管蛋白α-2(tubulinα-2)，點D是微管蛋白β-15(tubulinβ-15)，點E為原肌球蛋白(TM)。

3 討論

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤細胞，能合成、貯存并釋放適量的兒茶酚胺。用NGF處理該細胞，可使其分化為交感神經(jīng)元樣細胞，從而在形態(tài)、生理、生化及功能方面更接近于神經(jīng)元，是在分子水平上研究神經(jīng)元分化的重要模型。

與傳統(tǒng)生物化學方法相比，蛋白質(zhì)組學是一種高通量、高分辨率的蛋白質(zhì)研究方法，擯棄了對單一或少數(shù)蛋白質(zhì)分割式的研究模式，使得在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其特有的活動規(guī)律成為可能，從而獲得有關蛋白質(zhì)性質(zhì)、表達變化及翻譯后修飾等方面的大規(guī)模信息。隨著研究不斷深入，蛋白質(zhì)組學在解釋諸如生長、發(fā)育、代謝調(diào)控等生命活動規(guī)律上將有所突破，也將為探討重大疾病的發(fā)病機制、診斷和預防、新藥開發(fā)提供重要的理論基礎。本實驗結(jié)果顯示，NGF誘導PC12細胞分化96 h，神經(jīng)絲蛋白(NF-M和NF-L)、微管蛋白tubulinα-2和tubulinβ-15以及TM這5種細胞骨架蛋白表達顯著增高，而NGF誘導PC12細胞分化6 h，上述蛋白質(zhì)表達與對照組比較均無變化。

微管是細胞骨架中最粗的一種纖維絲，是細胞內(nèi)囊泡、細胞器和蛋白質(zhì)交通運輸?shù)能壍?。微管蛋白為球形分子，分為兩種類型:α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，這兩種微管蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，能夠緊密地結(jié)合成二聚體，作為微管組裝的亞基，能夠聚合并且參與細胞分裂。β-tubulin有Ⅰ～Ⅵ六種亞型，其中Ⅱ、Ⅲ型是神經(jīng)元特異性蛋白，在NGF作用于PC12細胞時其表達量增高數(shù)倍〔2〕。本實驗中β-tubulin含量顯著增高可能是Ⅱ、Ⅲ型β-tubulin表達上調(diào)所致。

NF是神經(jīng)元特有的中間絲蛋白(10～12 nm)，分為NF-L、NF-M和NF-H三種不同類型。它們與其他中間絲蛋白相互聚合形成網(wǎng)絡，主要起支持作用，是構(gòu)成神經(jīng)元骨架的主要成分。已有研究報道NGF誘導分化的PC12細胞中NF-L和NF-M表達增強〔3〕，這與本實驗結(jié)果符合。

微絲為直徑5～6 nm的雙股螺旋細絲，由肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和輔肌球蛋白組成。本實驗中，點E被鑒定為TM，它是上述微絲收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。Barbara等曾報道:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)作用于成神經(jīng)細胞瘤細胞使TM-3上調(diào)，而NGF處理的TrkA-SY5Y細胞中該蛋白表達下調(diào)〔4〕。本實驗中NGF處理組TM表達顯著增高，這可能是由不同細胞系和不同實驗條件所造成。TM上調(diào)與NGF引發(fā)的PC12細胞分化、細胞骨架蛋白表達增高等一系列現(xiàn)象相符，并可增強細胞的活動能力。

比較NGF處理6 h和96 h兩組實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):NGF處理96 h時PC12細胞發(fā)生顯著形態(tài)學變化，此時許多蛋白質(zhì)表達發(fā)生顯著變化。其中 NF-M、NF-L、tubulinα-2、tubulinβ-15和 TM等細胞結(jié)構(gòu)蛋白表達顯著上調(diào)，這與細胞形態(tài)學觀察所見相符。這些差異主要反映了NGF形態(tài)學變化和細胞構(gòu)成變化的一致性。本實驗為研究NGF誘導PC12細胞分化的機制提供了線索，也為深入進行神經(jīng)保護藥物的研發(fā)提供了新的線索。

1 孫小單，李羽佳，佟曉杰.神經(jīng)生長因子促進神經(jīng)再生作用的研究進展〔J〕.遼寧醫(yī)學院學報，2010;31(4):377-80.

2 Joshi HC，Cleveland DW.Differential utilization of beta-tubulin iso-types in differentiating neurites〔J〕.JCell Biol，1989;109:663-73.

3 Schimmelpfeng J，Weibezahn KF，Dertinger H.Quantification of NGF-dependent neuronal differentiation of PC-12 cells by means of neuro-filament-L mRNA expression and neuronal outgrowth〔J〕.J Neurosci Methods，2004;139(2):299-306.

4 Sitek B，Apostolov O，Stuhler K，et al.Identification of dynamic proteome changes upon ligand activation of Trk-receptors using two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Mol Cell Proteomics，2005;4(3):291-9.