陳松旺，周云，孟凡榮，趙美麗

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院超聲科，江蘇 南京 210006

兔VX2肝癌模型的建立，常用開腹與超聲引導(dǎo)下穿刺接種法，穿刺法較開腹接種法損傷小、并發(fā)癥少，被國內(nèi)大多數(shù)研究者采用。本研究采用開腹和超聲引導(dǎo)下深植入法和淺植入法建立兔肝VX2腫瘤模型，比較2種接種方法的腫瘤接種成功率和異位種植率，尋找更為合適的超聲引導(dǎo)下穿刺種植建模方法。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

選取健康新西蘭白兔80只（南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供），體重2.0～2.5kg，雌雄不限。兔VX2腫瘤組織由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。組織塊接種采用14G穿刺針（日本八光），組織塊懸液接種采用18G穿刺針（日本八光）。3%戊巴比妥鈉1mL/kg，耳緣靜脈注射麻醉。明膠海綿（南京金陵制藥廠生產(chǎn))預(yù)先剪碎備用，每塊大小1mm3。Philips HDI5000 型彩色多普勒超聲診斷儀,探頭頻率為5~12MHz。

1.2 荷瘤兔制作方法

將凍存的VX2腫瘤組織塊復(fù)蘇后，在超凈臺(tái)內(nèi)用PBS液沖洗組織塊3遍，用眼科剪將組織塊剪成大小約1mm3的瘤粒，用配有18G針頭的1mL注射器抽吸1mL瘤粒懸浮液，注入兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)，2周后于接種部位可捫及實(shí)質(zhì)性包塊，即制成荷瘤兔。第1只荷瘤兔制作成功后，可取其部分瘤組織，按上述方法制作第2只荷瘤兔。

1.3 腫瘤組織塊及組織塊懸液制備

取荷瘤兔1只，瘤塊所在側(cè)大腿部位備皮消毒，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1mL/kg）麻醉后，剪開并分離局部皮膚及皮下組織，剝離腫瘤，將腫瘤完整取出。

1.3.1 腫瘤組織塊的制備

用眼科剪將腫瘤邊緣灰白色魚肉樣組織，剪成約1mm×1mm×3mm大小的瘤塊備用。

1.3.2 腫瘤組織塊懸液的制備

用眼科剪將腫瘤組織塊剪成大小約1mm3的微塊，用18G的穿刺針接上1mL注射器抽吸帶有腫瘤組織塊和細(xì)胞懸液的生理鹽水約1mL備用。

1.4 腫瘤肝內(nèi)接種方法

健康新西蘭大白兔80只，隨機(jī)分為開腹組及超聲組（每組40只）。開腹組及超聲組再分為組織塊組20只（其中，淺植入法10只，深植入法10只）。

腫瘤接種方法如下：

1.4.1 腫瘤組織塊組

實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前禁食8h以上，麻醉成功后，仰臥位固定于兔臺(tái)上，手術(shù)常規(guī)剪毛，消毒鋪巾。開腹組：自劍突下偏左側(cè)切開20mm的切口，鈍性分離后，暴露肝臟。用生理鹽水濕紗布輕柔地將兔肝左葉拉出體外，14G穿刺針穿入預(yù)設(shè)深度肝左葉實(shí)質(zhì)內(nèi)，固定針鞘，拔出針芯，用眼科鑷夾將1塊剪碎的瘤塊放入針鞘內(nèi)，用平頭針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù)2~3次；再用平頭針芯將1塊明膠海綿推入肝內(nèi)，重復(fù)1~2次，確定接種成功后拔出穿刺針，局部壓迫片刻止血，確認(rèn)無出血后回納肝臟。切口縫合后碘伏消毒，待兔蘇醒后送回兔籠觀察。超聲組：不需開腹，超聲掃查兔左肝，確定穿刺點(diǎn)，在超聲引導(dǎo)下用14G穿刺針穿入預(yù)設(shè)深度肝左葉實(shí)質(zhì)內(nèi)，固定針鞘，拔出針芯，以下操作同上。種植結(jié)束后退出穿刺針。

1.4.2 腫瘤組織塊懸液組

操作同1.4.1，抽取腫瘤組織塊懸液1mL，開腹及超聲導(dǎo)引下穿刺，將懸液注入預(yù)設(shè)深度肝左葉實(shí)質(zhì)內(nèi)。

接種完成后，連續(xù)3d肌注青霉素5萬U/kg，慶大霉素2.5mg/kg(或 0.25 萬 U/kg )。

1.4.3 腫瘤種植深度預(yù)設(shè)

淺植入組：穿刺針穿刺進(jìn)入兔肝左葉深度≤20mm。深植入組：穿刺針穿刺進(jìn)入兔肝左葉深度>20mm。

1.5 觀察指標(biāo)

各組分別于接種術(shù)后第1周、2周、3周行超聲檢查，對兔肝腫瘤的形態(tài)、大小、內(nèi)部回聲及瘤體血供進(jìn)行觀察，并于3周后處死動(dòng)物，剖腹觀察腫瘤在肝內(nèi)生長情況及腹腔和腹壁異位種植情況。剖開腫瘤，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)HE染色觀察腫瘤的組織學(xué)特征。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理, 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)。各組異位種植率的比較，用x2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤肝內(nèi)接種生長及異位種植

2.1.1 腫瘤肝內(nèi)接種生長

本實(shí)驗(yàn)80只兔，開腹及超聲引導(dǎo)下造模，接種后超聲觀察均可見腫瘤生長，成模率均為100%。

2.1.2 異位種植

組織塊深植入組：開腹組及超聲組均無異位種植。組織塊淺植入組：開腹組無異位種植，超聲組1例腹腔種植。組織塊懸液深植入組：開腹組無異位種植，超聲組2例腹腔種植。組織塊懸液淺植入組：開腹組2例腹腔種植；超聲組5例腹腔種植，其中1例同時(shí)腹腔和腹壁種植。腹腔種植兔腹腔內(nèi)可見血性腹水。經(jīng)x2檢驗(yàn)：超聲組組織塊懸液淺植入法較開腹組組織塊深植入法和淺植入法、組織塊懸液組深植入法，超聲組組織塊深植入法異位種植率高（P<0.05），余組間異位種植率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）,見表1。

2.2 接種后肝內(nèi)腫瘤大小

3周后超聲測量腫瘤大小，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示：開腹組及超聲組組織塊組腫瘤體積明顯大于組織塊懸液組。組織塊組腫瘤大小明顯大于組織塊懸液組。組織塊深植入組腫瘤大小與淺植入組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織塊懸液深植入組腫瘤大小與淺植入組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

2.3 腫瘤的超聲檢查

超聲檢查兔肝左葉或異位種植的腹腔或腹壁，可探及圓形或類圓形低至中等回聲結(jié)節(jié)， 無包膜，邊界欠清楚，周邊無低回聲暈。當(dāng)腫瘤內(nèi)出現(xiàn)部分壞死時(shí)，可見部分無回聲區(qū)（如圖1所示）。彩色多普勒檢查，可見腫瘤周邊及內(nèi)部血流信號，以周邊血供為主，中央血供少，呈星點(diǎn)狀、短條狀，頻譜多普勒可引出動(dòng)脈樣血流信號及靜脈樣血流信號（如圖2所示）。

圖1 種植兔肝左葉腫瘤二維圖像

圖2 兔肝左葉腫瘤彩色及頻譜多普勒圖像

2.4 腫瘤的肉眼及病理特點(diǎn)

圖3 兔肝左葉腫瘤病理（低倍鏡下：10×）

圖4 兔肝左葉腫瘤病理（高倍鏡下：40×）

表1 組織塊組與組織塊懸液組

腫瘤在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)呈結(jié)節(jié)狀，無包膜。腫瘤結(jié)節(jié)呈灰白色，魚肉樣，質(zhì)硬，其內(nèi)可見豐富的供瘤血管。光鏡下:低倍鏡下正常肝組織內(nèi)見多灶浸潤性癌巢，與正常肝實(shí)質(zhì)分界清楚（如圖3所示）。高倍鏡下瘤細(xì)胞呈條索狀或腺樣排列，細(xì)胞呈多邊形，胞質(zhì)較豐富，核圓形或卵圓形，異型明顯并可見核分裂象，瘤組織間壞死明顯（如圖4所示）。

3 討論

3.1 兔VX2肝癌動(dòng)物模型

兔VX2肝癌動(dòng)物模型腫瘤細(xì)胞株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌，經(jīng)過72次移植傳代后正式建立株，命名為VX2[1]。它可接種在兔的肝臟、腎臟、肌肉等處。病理學(xué)上腫塊為實(shí)體瘤，浸潤性生長，血供豐富，可見巨大腫塊并瘤周子灶形成，類似于巨塊型肝癌。該模型制作簡便易行，價(jià)格相對低廉，實(shí)驗(yàn)周期短[2]。該模型類似人的肝細(xì)胞肝癌，常將其用于肝癌診斷、治療的基礎(chǔ)研究[3-4]。

3.2 兔VX2肝癌接種

兔VX2肝癌接種方法主要有瘤細(xì)胞懸液接種法和開腹瘤塊包埋接種法[5-6]。早期多采用細(xì)胞懸液法制作VX2腫瘤模型，但其費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、種植成功率低，易發(fā)生轉(zhuǎn)移和針道種植。開腹瘤組織塊種植法雖然其方法簡單、成瘤率高、模型性質(zhì)穩(wěn)定，但每次接種耗費(fèi)時(shí)間較長，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受手術(shù)創(chuàng)傷較大，易發(fā)生術(shù)后感染、粘連、腫瘤壞死。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲引導(dǎo)下穿刺組織塊法及組織塊懸液法接種腫瘤，方法簡便、可行，創(chuàng)傷小，接種腫瘤成功率高，可取代剖腹手術(shù)肝腫瘤接種。但該方法在接種時(shí)以超聲引導(dǎo)下組織塊法深植入法為首選，其次為超聲引導(dǎo)下組織塊淺植入法及超聲引導(dǎo)下組織塊懸液法深植入法，不推薦使用超聲引導(dǎo)下組織塊懸液法植入法。組織塊法與組織塊懸液法相比，組織塊組腫瘤明顯大于組織塊懸液組。分析其原因可能是植入的組織塊懸液由于注射器推注的壓力，部分液體逆流到腹腔或腹壁，含瘤細(xì)胞的懸液不能全部聚集于肝左葉穿刺部位，同時(shí)組織塊懸液經(jīng)稀釋后細(xì)胞數(shù)減少，導(dǎo)致穿刺部位瘤細(xì)胞總量及聚集范圍變少。

3.3 異位種植發(fā)生的原因

腫瘤種植成功的判斷:在肝內(nèi)接種部位出現(xiàn)腫瘤生長，無鄰近器官、腹腔及腹壁種植者視為該腫瘤原位種植成功。不論肝內(nèi)接種部位有無發(fā)現(xiàn)腫瘤，在鄰近肝臟的其他臟器、腹壁或腹腔內(nèi)出現(xiàn)腫瘤生長者則視為該接種腫瘤異位種植。本研究中，開腹組組織塊懸液淺植入組、超聲組組織塊淺植入組及組織塊懸液深淺植入組都出現(xiàn)了異位種植。異位種植的原因[7-8]:① 經(jīng)穿刺針道逆流滲漏出的腫瘤細(xì)胞流到腹腔或腹壁；② 穿刺接種過程中穿刺針及針芯將腫瘤組織塊及液體帶出肝組織至腹腔或腹壁；③ 穿刺種植點(diǎn)離肝葉表面較淺，組織塊及其液體被擠出肝組織到腹腔或腹壁。

3.4 超聲引導(dǎo)下穿刺方法選擇

本研究表明，開腹法及超聲法接種腫瘤與腫瘤原位種植成功率沒有差別。但開腹接種方法兔損傷大，并發(fā)癥較多，而超聲引導(dǎo)下接種，方法簡單，創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，超聲引導(dǎo)下穿刺組織塊及組織塊懸液接種制作兔肝VX2腫瘤，組織塊植入法生長的腫瘤體積大于組織塊懸液法，組織塊深植入法未出現(xiàn)異位種植。所以，依據(jù)本研究結(jié)論，推薦超聲引導(dǎo)下穿刺組織塊深植入法種植腫瘤。

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