王大鵬，林洪麗，鄭美潔，謝 華，沈 楠，孫艷玲

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 大連 116011)

蛋白尿是慢性腎臟病進展至終末期腎功能衰竭的獨立危險因素[1]。研究表明：蛋白尿?qū)е履I小管上皮細(xì)胞損傷主要是通過其膜受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-2，LRP-2(megalin)介導(dǎo)白蛋白內(nèi)吞來實現(xiàn)的。Megalin是腎小管細(xì)胞上皮細(xì)胞吸收蛋白的主要受體，它被認(rèn)為是蛋白尿?qū)е履I小管上皮細(xì)胞炎癥損傷，腎間質(zhì)纖維化的始動因素[2，3]。Morelle W等[4]報告的megalin結(jié)構(gòu)表明megalin是一種跨膜糖蛋白，結(jié)構(gòu)中含有大量的核心巖藻糖鏈，提示megalin的病理生理功能可能受核心巖藻糖基化修飾。核心巖藻糖基化是糖蛋白翻譯后修飾的一種方式，是由α1-6-巖藻糖基轉(zhuǎn)酶(α1-6-fucosyltransferase,FUT8)催化完成的。較多的文獻報道了megalin通過內(nèi)吞蛋白在腎小管損傷過程中的關(guān)鍵作用[5-7]。但迄今為止，尚無megalin蛋白翻譯后糖基化修飾對其內(nèi)吞蛋白功能影響的報道。

本實驗利用白蛋白過負(fù)荷建立腎小管上皮細(xì)胞的損傷模型，通過外源轉(zhuǎn)導(dǎo)FUT8siRNA及FUT8全長cDNA，制備核心巖藻糖基化上調(diào)和下調(diào)的腎小管上皮細(xì)胞模型，從正反兩方面探討FUT8介導(dǎo)的核心糖基化修飾對于megalin內(nèi)吞白蛋白功能的影響，及其在白蛋白誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥損傷過程中扮演的角色。

1 材料和方法

1．1 細(xì)胞與主要試劑

永生化近端人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)(美國，ATCC)；FUT8siRNA及亂序siRNA片段(5′-UCCACACCGACGCCAUAGA-3′)(上海，吉瑪)，含人FUT8全長cDNA的EGFP-pcDNA3.0熒光表達質(zhì)粒，EGFP-pcDNA3.0熒光表達空質(zhì)粒(上海，吉凱)，生物素標(biāo)記的植物扁豆凝集素(Bio-LCA)，異硫氰酸標(biāo)記的植物扁豆凝集素(FITC-LCA)，羅丹明標(biāo)記牛血清白蛋白(TRITC-BSA) (美國，Vector)；抗FUT8抗體，抗MCP-1抗體,抗GAPDH抗體，抗megalin抗體，過氧化物酶標(biāo)記的親和素(Avidin-HRP)以及G蛋白親和珠子(美國，SantaCruz)。脂質(zhì)體2000(美國，Invitrogen)，過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗，羊抗鼠二抗，兔抗羊二抗，F(xiàn)ITC-羊抗兔二抗和FITC-兔抗羊二抗(北京，中杉金橋)。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。6孔板按1×105/孔接種細(xì)胞，待細(xì)胞60%～70%融合，隨機分為9組，正常對照組(Con)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液；無關(guān)序列對照組(Mock)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液，加入終濃度為30 nmol/L亂序的siRNA轉(zhuǎn)染52 h；空質(zhì)粒組(pcDNA3)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液，用終濃度為4 μg/mL pcDNA3.0空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，孵育52 h。脂質(zhì)體2000對照組(Lip)：濃度為30 nmol/L 脂質(zhì)體2000孵育細(xì)胞52 h；BSA刺激組(BSA)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液48 h，加入終濃度為10 mg/mL的BSA孵育4 h；BSA加FUT8低表達組(BSAFlow)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液，加入終濃度為30 nmol/L FUT8siRNA孵育48 h，再加入濃度為10 mg/mL的BSA孵育4 h；BSA加FUT8高表達組(BSAFhigh)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液，加入終濃度為4 μg/mL的FUT8過表達質(zhì)粒孵育48 h后，再加入濃度為10 mg/mL BSA作用 4 h；FUT8干擾組(FUT8IOW)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液并加入終濃度為30 nmol/L的FUT8siRNA孵育52 h；FUT8高表達組(FUT8high)：細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液并加入終濃度為4 μg/mL的全長FUT8cDNA孵育52 h。

1．3 FUT8siRNA以及FUT8過表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染

化學(xué)合成的4個FUT8siRNA片段(5′-UCCGACACCGAUACCGACA-3′; 5′-GGGUGUCUCAGUUUGUCAA-3′; 5′-GGUGCAUGUUGAAGAACAUTT-3′;和 5′-GGUGUGUAAUAUCAACAAATT-3′)混合后形成一個siRNA池，以轉(zhuǎn)染細(xì)胞；提前24 h將細(xì)胞種植在6孔板上，用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后將終濃度為30 nmol/L FUT8siRNA或4 μg/mL的FUT8全長cDNA的EGFP熒光標(biāo)記的pcDNA3.0表達質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效果，24 h后測定轉(zhuǎn)染效率。

1．4 免疫印跡

用RIPA溶解細(xì)胞，細(xì)胞溶解產(chǎn)物15000 r/min離心10 min取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度，煮沸變性后，加樣至12%SDS-PAGE中電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST液封閉，室溫1 h，山羊抗人FUT8抗體(1∶400)、兔抗人megalin(1∶400)，小鼠抗人GAPDH(1∶400)雜交，4 ℃過夜，TBST洗膜后依次加入過氧化物酶標(biāo)記二抗及ECL曝光，應(yīng)用圖像分析軟件定量分析蛋白相對表達量。

1．5 免疫沉淀以及凝集素親和印跡

取500 μg的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，加入抗megalin抗體 2 μg，4 ℃，搖床上混合2 h。陰性對照組中不加抗體。上述抗原-抗體混合物中分別加入20 μL G蛋白親和珠子，4 ℃搖床混合過夜，2500 r/min 離心 5 min，取沉淀，RIPA洗滌3次，煮沸變性，上樣至12%SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，1%BSA封閉1 h，加入Bio-LCA(1∶200)，37 ℃孵育1 h，TTBS洗膜3次后加入Avidin-HRP(1∶6000)，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜3次，ECL曝光，圖像分析軟件(LabworksTMImage Acquisition )分析蛋白相對表達量。

1．6 白蛋白的綁定和吸收分析

用流式細(xì)胞儀檢測來評估細(xì)胞的熒光強度。即：用終濃度為100 μg/mL的TRITC-BSA于4℃(測定綁定)或者37℃(測定吸收)孵育細(xì)胞1 h，冷PBS洗5次，終止白蛋白吸收。取10000個細(xì)胞分析，結(jié)果用平均熒光強度來表示。

1．7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2．1 BSA的綁定和內(nèi)吞特點

HK-2呈現(xiàn)出劑量和時間依賴性的綁定和內(nèi)吞。用不同濃度的BSA，37°C孵育細(xì)胞時，BSA以濃度依賴性的方式被吸收，在濃度為2 mg/mL時蛋白內(nèi)吞達到最大值，4 h達到飽和。4°C孵育細(xì)胞時，BSA以濃度依賴性的方式綁定細(xì)胞，濃度為2.5 mg/mL時蛋白綁定達到最大值，5 h達到飽和，見圖1。

圖1 HK-2細(xì)胞BSA的綁定和內(nèi)吞特點

2．2 轉(zhuǎn)染效率及各對照組目的基因蛋白表達水平對比

FUT8siRNA轉(zhuǎn)染效率達95%，F(xiàn)UT8高表達載體轉(zhuǎn)染效率達96%；Con組與Lip組之間的FUT8、megalin、MCP-1的蛋白表達的差異無顯著性意義，因此，在后續(xù)的實驗中略去Lip組，見圖2。

2.3 FUT8基因的沉默和過表達

同陰性對照組相比，F(xiàn)UT8 siRNA孵育HK-2細(xì)胞48 h后，能明顯抑制FUT8的蛋白和RNA的表達水平，最大的抑制效率達到(75±5)%；與陰性對照組相比，F(xiàn)UT8過表達質(zhì)粒孵育HK-2細(xì)胞48 h后，能夠明顯升高FUT8蛋白表達水平(P<0.05)，見圖3。

2．4 BSA的綁定和內(nèi)吞與Megalin核心巖藻糖基化的變化

與BSA組細(xì)胞相比，BASFhigh組細(xì)胞白蛋白的綁定和內(nèi)吞能力明顯增強(P<0.05)，而BASFlow組細(xì)胞對白蛋白的綁定和內(nèi)吞能力明顯下降(P<0.05)，見圖4。

2．5 Megalin的核心巖藻糖基化對MCP-1的影響

BSA孵育4 h后，各組細(xì)胞Megalin的表達差異并無顯著性意義(P>0.05)。與正常組對比，BSA組細(xì)胞megalin核心巖藻糖基化表達水平明顯升高(P<0.05)；與BSA組相比，BSAFhigh組細(xì)胞核心巖藻糖基化水平顯著升高(P<0.05)，BSAFlow組細(xì)胞的核心巖藻糖基化水平顯著下降(P<0.05)。與正常組的核心巖藻糖基化水平相當(dāng)，見圖5(A)；與正常組相比，BSA組細(xì)胞MCP-1明顯升高(P<0.05)；與BSA組相比，BSAFhigh組細(xì)胞的MCP-1表達水平顯著升高(P<0.05)，而BSAFlow組的MCP-1表達水平顯著下降(P<0.05)，見圖5B。

3 討 論

Megalin被認(rèn)為是觸發(fā)尿蛋白超負(fù)荷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的起始因素。它表達于腎小管上皮細(xì)胞，介導(dǎo)尿蛋白的過量吸收，導(dǎo)致腎小管細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活NF-κB因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化[8]。Motoyoshi等[7]報道，當(dāng)小鼠腎小管上皮細(xì)胞的megalin被敲除后，腎小管就無法吸收白蛋白，而表達meglain的腎小管細(xì)胞能促發(fā)許多炎癥因子的釋放，如：血紅素-加氧酶-1和MCP-1。他們的實驗提示，megalin對于腎小管上皮細(xì)胞對于白蛋白的吸收是必須的，炎癥因子MCP-1的釋放是megalin介導(dǎo)的蛋白內(nèi)吞依賴性的。本實驗組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，核心巖藻糖基化在腎小管細(xì)胞EMT作用過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，是TGF-betaRII,ALK5兩種糖基化受體發(fā)揮作用所必須的糖基化修飾[9]，對megalin的糖結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)其含有大量的核心巖藻糖基化結(jié)構(gòu)[4]。據(jù)此，本實驗首次對megalin的核心巖藻糖基化在炎癥反應(yīng)中的作用進行了研究。

圖2 轉(zhuǎn)染效率以及對照組目的基因表達對比

圖3 不同處理因素對FUT8表達的影響

圖4 BSA的綁定和內(nèi)吞與Megalin核心巖藻糖基化的變化

本實驗組首先成功的建立了FUT8干擾以及高表達的細(xì)胞模型，接著測定了核心巖藻糖基化對megalin綁定和內(nèi)吞白蛋白的影響。結(jié)果顯示，megalin核心巖藻糖基化水平上調(diào)能促進它對于白蛋白的綁定和內(nèi)吞，而megalin核心巖藻糖基化的下調(diào)則抑制它對白蛋白的綁定和內(nèi)吞。Zhang等[10]人的研究結(jié)果有力地支持了本實驗的發(fā)現(xiàn)。他們實驗表明，核心2O-寡糖能提高megalin蛋白配基綁定能力以及megalin的吸收能力。并且認(rèn)為，megalin的細(xì)胞外的糖基化結(jié)構(gòu)能夠影響受體活性和配基的綁定親和力。本研究結(jié)果提示：作為megalin結(jié)構(gòu)中的主要糖基化修飾結(jié)構(gòu)，核心巖藻糖基化修飾對于megalin發(fā)揮功能起到關(guān)鍵性作用。

圖5 Megalin的核心巖藻糖基化對MCP-1的影響

為了研究FUT8催化的核心巖藻糖基化在白蛋白超負(fù)荷損傷過程中的作用，本研究用10 mg/mL的白蛋白孵育HK-2細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)孵育4 h后，HK-2細(xì)胞中出現(xiàn)MCP-1上調(diào)，說明白蛋白可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞炎癥損傷。本研究又通過沉默及過表達FUT8基因發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT8高表達能上調(diào)megalin的核心巖藻糖基化水平，上調(diào)MCP-1表達，而沉默F(xiàn)UT8基因能下調(diào)meglain核心巖藻糖基化表達水平，下調(diào)MCP-1表達。Donadelli等[8]在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)，蛋白內(nèi)吞增加直接導(dǎo)致了MCP-1的分泌增加，而內(nèi)吞減少則直接導(dǎo)致其分泌減少。本實驗結(jié)果表明，核心巖藻糖基化對meglain綁定和內(nèi)吞功能是必不可少的。

本實驗結(jié)果表明，核心巖藻糖基化修飾是megalin發(fā)揮白蛋白綁定和內(nèi)吞功能的必需過程，抑制megalin蛋白合成后的核心巖藻糖基化修飾能夠減輕蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子的表達。

參考文獻：

[2] Christensen EI,Nielsen R.Role of megalin and cubilin in renal physiology and pathophysiology[J].Rev Physiol Biochem Pharmacol,2007,158:1-22.

[3] Christensen EI,Birn H.Multifunctional endocytic receptors[J].Nature Rev Molecular Cell Biol,2002,3:258-268.

[4] Morelle W,Haslam SM,Ziak M,et al.Characterization of the N-linked oligosaccharides of megalin (gp330) from rat kidney [J].Glycobiology,2000,10:295-304.

[5] Lee SH,Takahashi M,Honke K,et al.Loss of core fucosylation of low-density lipoprotein receptor-related protein-1 impairs its function,leading to the upregulation of serum levels of insulin-like growth factor-binding protein 3 in FUT8-/- mice[J].J Biochem,2006,139:391-398.

[6] Christensen EI,Nielsen R.Role of megalin and cubilin in renal physiology and pathophysiology[J].Rev Physiol Biochem Pharmacol,2007,158:1-22.

[7] Motoyoshi,Taiji Matsusaka,Akihiko Saito,et al.Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria[J].Kidney International,2008,74:1262-1269.

[8] Donadelli R,Abbate M,Zanchi C,et al.Protein traffic activates NF-kB gene signaling and promotes MCP-1-dependent interstitial inflammation[J].Am J Kidney Dis,2000,36:1226-1241.

[9] Lin H,Wang D,Wu T,et al.Blocking the core fucosylation of TGF-{beta}1-receptors down-regulates their functions and attenuates the epithelial mesenchymal transition of renal tubular cells[J].Am J Physiol Renal Physiol,2011 Jan 12.[Epub ahead of print]

[10] Zhang H,Yoshioka S,Miyazaki M,et al.Core 2 GlcNAc modification and megalin ligand-binding activity[J].Biochim Biophys Acta,2008,780:479-485.