喬海嬌，林鵬飛，王愛華

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

Zhangfei（ZF）又稱為 CREBZF，屬于 CREB（cAMP－response－element－binding protein）／ATF（activating transcription factor）家族成員之一，是目前發(fā)現(xiàn)的第2個能夠與單純皰疹病毒1型（Herpes simplex virus－1，HSV－1）相關(guān)聯(lián)的宿主細(xì)胞因子1（host cell factor 1，HCF－1）相互作用的堿性亮氨酸拉鏈（basic region－leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子［1］。與大多bZIP不同的是，ZF不能以同型二聚體的 形 式 與 DNA 相 結(jié) 合［1－2］。 但 是 ZF 能 夠 與VP16［3］、Luman［4］、ATF4［5］以 及trkA［6］等 形 成 異型二聚體，從而正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控下游基因的表達(dá)。目前的研究認(rèn)為ZF不能作為同型二聚體結(jié)合到DNA的主要原因是在其結(jié)構(gòu)的NxxAAxxCR區(qū)缺乏一個關(guān)鍵的天冬氨酸殘基［1－3］。

至今ZF的具體生物學(xué)功能還不是十分清楚。它以一種類似于Luman和轉(zhuǎn)錄激活因子VP16相結(jié)合的方式與 HCF－1相結(jié)合，抑制了VP16－HCF－1－Oct－1復(fù)合體的形成，從而阻止了HSV－1立即早期（IE）基因的表達(dá)［3］。ZF能夠有效地和 HCF－1結(jié)合，推測其可能在細(xì)胞的增殖和分化中起著一個很重要的作用。ZF和ATF4形成的異型二聚體在哺乳動物的未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）中起著很重要的作用［5－7］。同時，ZF以依賴HCF－1的方式抑制Luman的表達(dá)［4］，而Luman是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時的一個關(guān)鍵因子［8］?，F(xiàn)有的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與哺乳動物胚胎和胎兒的正常發(fā)育有著密切的關(guān)系［9－11］。由此可見，ZF不但參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)，其在胚胎發(fā)育、人類疾病等生理和病理過程中也具有重要的意義。目前，國內(nèi)外尚未見ZF在生殖內(nèi)分泌領(lǐng)域相關(guān)研究的報(bào)道。為此，本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察了ZF蛋白在不同動情周期小鼠卵巢與子宮中的分布規(guī)律，為進(jìn)一步探討ZF的生物學(xué)功能提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選用20只8周齡±10周齡的雌性昆明小鼠，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫、自然光照、自由進(jìn)食飲水和籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周～2周，采用陰道涂片法對小鼠動情周期進(jìn)行觀察與判斷，選擇連續(xù)2個周期正常者用于試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 小鼠免疫組化檢測試劑盒為北京四正柏生物科技有限公司產(chǎn)品，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。鼠抗ZF的克隆抗體由農(nóng)業(yè)部動物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 小鼠發(fā)情周期的確定 將小鼠保定，提起尾巴暴露陰道口，觀察外陰特征并記錄。右手持滴管吸少量生理鹽水滴入陰道口，稍放松尾部及腰部，生理鹽水被吸入陰道，稍候，用滴管吸出液體，滴到載玻片上。待稍干后用酒精（950mL／L）固定5min，然后用伊紅染液染色5min，隨后沖片，蘇木精染30 min，沖片，封片，鏡檢。根據(jù)各時期細(xì)胞學(xué)特征判斷動情周期各個階段。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 小鼠脫頸椎致死，分別取出動情周期各階段的卵巢與子宮，立即置于40 mL／L多聚甲醛中固定48h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm。組織切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)后，在30mL／L H2O2中室溫孵育30min，除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，ZF的克隆抗體（1∶400稀釋）4℃過夜，其余步驟按免疫組織化學(xué)SP試劑盒說明操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 ZF蛋白在小鼠動情周期卵巢中的分布

ZF在各級卵泡的卵母細(xì)胞中均呈陽性分布，并且主要定位于胞質(zhì)中（圖1A～D）。原始卵泡和初級卵泡的顆粒細(xì)胞中未見ZF陽性染色，當(dāng)卵泡發(fā)育至次級卵泡階段時，顆粒細(xì)胞層中可見ZF蛋白的陽性分布；成熟卵泡的顆粒細(xì)胞中ZF蛋白的陽性分布更加明顯。此外，在整個動情周期的黃體中均有ZF陽性分布，而在凋亡的顆粒細(xì)胞和各級卵泡的泡膜細(xì)胞中無分布。

圖1 ZF蛋白在小鼠動情周期卵巢中的免疫組織化學(xué)定位（400×）Fig.1 Immunohistological localization of ZF in the ovaries of mice during estrous cycle（400×）

2.2 ZF蛋白在小鼠動情周期子宮中的分布

免疫組化結(jié)果表明，ZF在小鼠整個動情周期的子宮組織中都有分布（圖2A～D）。ZF主要分布于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞中，而在子宮間質(zhì)細(xì)胞與子宮肌層中未見陽性染色。其中，ZF在間情期表達(dá)較強(qiáng)，發(fā)情期表達(dá)較弱。

圖2 ZF蛋白在小鼠動情周期子宮中的免疫組織化學(xué)定位（400×）Fig.2 Immunohistological localization of ZF in the uterus of mice during estrous cycle（400×）

3 討論

ZF作為CREB／ATF家族成員之一，在成人和胎兒組織中廣泛表達(dá)［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ZF在哺乳動物的 UPR中起著重要的調(diào)節(jié)作用［5－8］。UPR參與介導(dǎo)了DDK綜合癥小鼠的胚胎早期死亡過程，在死亡胚胎細(xì)胞中GRP78與ATF4表達(dá)量顯著增加［12］。而ZF可以和ATF4通過bZIP區(qū)域相互結(jié)合形成異型二聚體，通過調(diào)節(jié)其對DNA的結(jié)合能力或改變ATF4的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)整下游基因的表達(dá)［13］。飼喂高脂日糧的雌性小鼠其卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus－oocyte complex，COCs）中ATF4和GRP78的表達(dá)量顯著上升，同時伴隨著排卵率及受精率的下降［14］。另外，ZF還可以和Luman，ATF6及XBP1等與UPR相關(guān)的bZIP蛋白相互作用。雙敲除ATF6和ATF6β的小鼠其胚胎在發(fā)育的早期階段發(fā)生死亡現(xiàn)象［15］?，F(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果均表明，UPR在生殖功能調(diào)節(jié)中具有重要作用。

顆粒細(xì)胞是組成成熟卵泡的最大細(xì)胞群，在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細(xì)胞的增殖、分化對卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟起重要作用。顆粒細(xì)胞通過縫隙連接，與卵母細(xì)胞進(jìn)行自分泌和旁分泌的信息交流，為卵母細(xì)胞的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)卵泡內(nèi)的pH。卵母細(xì)胞指導(dǎo)了顆粒細(xì)胞的增殖、分化；同時顆粒細(xì)胞也影響卵母細(xì)胞的成熟和排卵［16］。ZF在小鼠卵巢中表達(dá)位置隨動情周期卵泡的生長變化而變化，原始卵泡和初級卵泡的顆粒細(xì)胞中未見ZF蛋白分布，當(dāng)顆粒細(xì)胞由兩層增殖到多層時ZF蛋白的陽性表達(dá)明顯增加；而在各級卵泡卵母細(xì)胞的胞質(zhì)中均有ZF蛋白分布。此外，在整個動情周期的黃體中均有ZF陽性分布，而在凋亡的顆粒細(xì)胞和各級卵泡的泡膜細(xì)胞中無分布。推論ZF可能與卵巢中的類固醇激素合成有關(guān)，促進(jìn)卵泡發(fā)育及確保優(yōu)勢卵泡和排卵后黃體的形成。

另外，一般認(rèn)為，卵巢合成的類固醇激素調(diào)節(jié)著動情周期中子宮發(fā)生的一系列周期性變化。小鼠子宮內(nèi)膜常伴隨卵巢激素水平的改變而發(fā)生周期性的變化。動情前期血清中的雌激素水平開始升高，動情期達(dá)到峰值，到動情后期時出現(xiàn)下降，動情間期降至最低；孕酮水平則在動情后期達(dá)到最高，在動情間期迅速下降。卵巢類固醇激素的這種周期性變化調(diào)控子宮中許多基因的表達(dá)［17］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在整個動情周期中ZF廣泛分布于小鼠的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞中，這提示ZF在子宮內(nèi)膜的免疫調(diào)節(jié)、腺體的分泌等方面可能發(fā)揮重要的作用。本試驗(yàn)僅對ZF在小鼠動情周期子宮與卵巢中的分布變化規(guī)律進(jìn)行了研究，關(guān)于ZF在卵巢及子宮功能調(diào)控中的分子作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

［1］Lu R，Misra V.Zhangfei：a second cellular protein interacts with herpes simplex virus accessory factor HCF in a manner similar to Luman and VP16［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：2446－2454.

［2］Cockram G P，Hogan M R，Burnett H F，et al.Identification and characterization of the DNA－binding properties of a Zhangfei homologue in Japanese pufferfish，Takifugu rubripes［J］.Biochem Biophys Res Commu，2006，339（4）：1238－1245.

［3］Akhova O，Bainbridge M，Misra V.The neuronal host cell factor－binding protein Zhangfei inhibits herpes simplex virus replication［J］.J Virol，2005，79（23）：14708－14718.

［4］Misra V，Rapin N，Akhova O，et al.Zhangfei is a potent and specific inhibitor of the host cell factor－binding transcription factor Luman［J］.J Biol Chem，2005，280：15257－15266.

［5］Hogan M R，Cockram G P，Lu R.Cooperative interaction of Zhangfei and ATF4in transactivation of the cyclic AMP response element［J］.FEBS Letters，2006，580（1）：58－62.

［6］Valderrama X，Rapin N，Misra V.Zhangfei，a novel regulator of the human nerve growth factor receptor，trkA［J］.J Neurovirol，2008，14（5）：425－436.

［7］Valderrama X，Rapin N，Verg V M，et al.Zhangfei induces the expression of the nerve growth factor receptor，trkA，in medulloblastoma cells and causes their differentiation or apoptosis［J］.Neurooncology，2009，91（1）：7－17.

［8］Denboer L M，Hardy－Smith P W，Hogan M R，et al.Luman is capable of binding and activating transcription from the unfolded protein response element［J］.Biochem Biophys Res Commu，2005，331（1）：113－119.

［9］Ran H，Zhu Y F，Ma X，et al.Differential expression of glucose－regulated protein 78during spermatogenesis［J］.Cell Tissue Res，2004，316（3）：359－367.

［10］Luo S Z，Mao C H，Lee B，et al.GRP78／BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development［J］.Mol Cell Biol，2006，26（15）：5688－5697.

［11］Kesugia K，Yamamotoa R，Mulhern M L，et al.Role of the unfolded protein response（UPR）in cataract formation［J］.Exp Eye Res，2006，83（3）：508－516.

［12］Barnes J A，smoalc I W.Glucose－regulated protein 78（GRP78）is elevated in embryonic mouse heart and induced following hypoglycemic stress［J］.Anatomy Embryol，2000，202（1）：67－74.

［13］Newman R S，Keating A E.Comprehensive identification of human bZIP interactions with coiled－coil arrays［J］.Science，2003，300（5628）：2097－2101.

［14］Lin L D，Wu Y，Kylie R.Dunning，et al.High－fat diet causes lipotoxicity responses in cumulus－oocyte complexes and decreased fertilization rates［J］.Endocrinology，2010，151（11）：5438－5445.

［15］Yamamoto K，Sato T，Matsui T，et al.Transcriptional induction of mammalian ER quality control proteins is mediated by single or combined action of ATF6αand XBP1［J］.Develop Cell，2007，3（3）：365－376.

［16］Jiang J Y，Xiong H L，Cao M J，et al.Mural granulosa cell gene expression associated with oocye developmental competence［J］.Ovarian Res，2010，3（1）：6－18.

［17］Yun S M，Choi K C，Kim I H，et al.Dominant expression of porcine Calbindin－D9kin the uterus during a luteal phase［J］.Mol Reprod，2004，67（3）：251－256.