黎滿香,林榮高,顏運(yùn)秋,卿泰安,盧 帥,蔣 偉,陳 滔

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,湖南長沙410128)

豬鏈球菌是引起豬鏈球菌病的主要病原,臨床上主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎以及關(guān)節(jié)炎,并還常與其他疾病混合感染,使病情更加復(fù)雜。豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引發(fā)豬鏈球菌病最主要的病原,目前已有35個血清型(1～34及1/2)被確定,其中豬鏈球菌2型流行最廣、致病性最強(qiáng)[1]。該菌的致病因子較為復(fù)雜,不同菌株的致病性不同,致病性的強(qiáng)弱取決于它的毒力因子,主要有莢膜多糖(capsular polysaccharide,cps),溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,mrp),胞外因子(extracellular factor,epf),溶血素(suilysin,sly)等[2-5]。目前我省豬鏈球菌分離株的毒力因子基因分布情況還不清楚。因此本試驗(yàn)對我省分離的豬鏈球菌2型進(jìn)行毒力因子的檢測和基因序列分析,初步了解我省主要的毒力因子和分子生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬鏈球菌2型分離株Hunan-An1、Hunan-An2、Hunan-CS、Hunan-Ping 共四株,分離于湖南省臨床送檢的豬病料,并按參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行生化及PCR鑒定,確定為豬鏈球菌2型[6],由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 Taq DNA Polymerasea購自天根生物工程公司;dNTP(2.5 mmol/L)、DL-2 000 DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限責(zé)任公司;凝膠回收試劑盒購自新長江生物技術(shù)有限公司;選擇性Todd-Hewitt肉湯(T HB)與血清瓊脂培養(yǎng)基均用分析純試劑配制。

1.3 引物設(shè)計 參照GenBank報道的相關(guān)基因序列分別設(shè)計引物,并由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。cps2j:上游 5′-ATGT TTGGAATACGCAGAGCAAG-3′,下游 5′-AGAGGACGTTC

GTT TAATACT TAG-3′;mrp:5′-CCAAGTATGGTGATGTCATTGT TG-3′,下游 5′-GGTACAT T TGGAATCTCTGGAATC-3′;epf:上游 5′-ACTCT TCTGAGCTGACGGAACAG-3′, 下 游 5′-TAGGTGTCATGACTGGTGCT TTAG-3′;sly:上游 5′-GTGACTTACGAGCCACAAGAGAT TC-3′,下游5′-ACTCCTACTGCTAGT TTCTAAC-3′;擴(kuò)增 片段大小分別為:717 bp 、773 bp、683 bp 、689 bp。

1.4 PCR擴(kuò)增及回收 10×PCR Buffer 2 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)1 μ L,上 、下游引物各 1 μ L,Taq 酶(2.5 U/μ L)0.5 μ L,加水至 20 μ L 總體系。具體反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán),72℃終延伸7 min,用0.75%瓊脂糖凝膠電泳分析檢測結(jié)果,檢測后再進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,按凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,本試驗(yàn)所用引物見上述。

1.5 PCR產(chǎn)物測序和序列分析 經(jīng)回收純化的DNA送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,將測序結(jié)果與國內(nèi)外已發(fā)表代表株的基因用DNAS-tar軟件進(jìn)行同源性比較分析。

2 結(jié)果

2.1 豬鏈球菌2型幾種毒力基因PCR電泳結(jié)果用上述合成引物對4株豬鏈球菌2型cps2j、mrp、epf、sly基因進(jìn)行擴(kuò)增,分別獲得預(yù)期目的片段大小相等為 717 bp、773 bp 、683 bp、689 bp(見圖 1)。2.2 豬鏈球菌2型4種毒力基因序列分析 將測序完的4株湖南省豬鏈球菌2型的cps2j、mrp、epf、sly基因部分序列與GenBank收錄同源基因進(jìn)行同源性、遺傳進(jìn)化比較。

圖1 4種毒力基因PCR電泳結(jié)果

2.2.1 同源性分析 運(yùn)用DNAStar軟件對序列進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)湖南4分離株的4種毒力基因cps2j、mrp 、ep f、sly的同源性在 4株間同源性在96.4%～100%之間,與國內(nèi)外其他分離株的同源性在95.7%～100%之間。其中,Hunan-An1、Hunan-An2,Hunan-Ping三分離株的mrp基因同源性在99.9%～100%,與德國DQ295197為96.1%,和其他參考株(包括 Hunan-CS)同源性在96.2%～97.1%。詳見圖2。

圖2 豬鏈球菌2型4種毒力基因遺傳進(jìn)化樹

2.2.2 遺傳進(jìn)化樹分析 從遺傳進(jìn)化樹(如圖2)分析顯示所有代表株cps2j基因有較多小分支,湖南4分離株與EU000466(江蘇),EF520108(貴州),EF520108(日本)等分離株同屬一末枝上,并與廣東分離株EF489401距離最遠(yuǎn)。epf和sly基因進(jìn)化樹上沒有大的分支,湖南4分離株緊密排列并同于一小分支上。Hunan-An1、Hunan-An2,Hunan-Ping在mrp進(jìn)化樹上同屬一末分支上,Hunan-CS和以上3株屬不同分支。其中 mrp基因中DQ295197(德國)、Hunan-CS及其他參考株、湖南其他3分離株分別同屬不同分支上。

3 討論

根據(jù)毒力不同,豬鏈球菌2型分為強(qiáng)毒株,弱毒株和無毒株,其致病機(jī)理目前還不很清楚,但普遍認(rèn)為其致病性與其毒力因子有關(guān)[7]。目前豬鏈球菌2型已被鑒定的毒力因子有mrp、epf、cps2j、sly[8]。這4種主要毒力因子在不同毒力菌株中的分布有較大差異,臨床分離菌株常存在1種乃至全部毒力基因的缺失現(xiàn)象,而典型的強(qiáng)毒株常帶有這4種毒力基因。為了解湖南分離株的豬鏈球菌2型毒力因子基因的情況,本試驗(yàn)對豬鏈球菌2型的4個毒力因子進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,4個湖南分離菌株均為cps2j+mrp+ep f+sly+,說明這4個豬鏈球菌2型湖南分離株均有典型強(qiáng)毒菌株特征。本試驗(yàn)對湖南豬鏈球菌2型的毒力基因檢測分析,給亞單位疫苗的研制提供一定理論依據(jù)。

核苷酸序列分析顯示,湖南省分離株與國內(nèi)報道的其他菌株3種毒力基因cps2j、epf、sly有很高的同源性(98%以上),遺傳進(jìn)化樹上沒有很大分支并與國外的荷蘭分離株、日本分離株、西班牙分離株進(jìn)化關(guān)系近,說明本省分離到的4株豬鏈球菌2型的這幾個基因沒有發(fā)生較大的變異。除Hunan-CS外,湖南分離株的mrp基因與其他參考菌株相比同源性低,進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn),有較大變異。湖南分離株與廣東分離株cps2j在進(jìn)化樹上親緣最遠(yuǎn)。說明在較小的地域范圍內(nèi)菌株間的某些毒力基因也可以存在較大差異,這與過去的一些報道相符[9]。同樣,對其他地區(qū)報道的序列比較發(fā)現(xiàn)在地理上較遠(yuǎn)的分離株間也有很近的親緣關(guān)系,說明這幾種毒力基因進(jìn)化關(guān)系與地域沒有密切的關(guān)系。

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