王康樂,陳佩林,馬以桐,葉 輝,印慶艷,朱道立

(南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南通226019)

骨骼肌是一個非均質(zhì)組織,存在功能多樣性是由于肌球蛋白存在多種亞型。肌球蛋白是熱休克蛋白,由2個重鏈(MHC)和4個輕鏈(MLC)組成 。肌球蛋白頭部重鏈在N-末端包含大量球狀的水解ATP動力結(jié)構(gòu)域和一個形成細(xì)絲的棒狀C-末端。肌球蛋白的這些部分被一個8.5 nm長的α-螺旋連接,稱為“肌球蛋白的頸部”,頸部與一個堿性的和一個調(diào)控的MLC相關(guān)聯(lián)。慢縮纖維通常含有堿性慢型MLC的亞型MLC1s和調(diào)控MLC的亞型MLC2s。同樣,快縮纖維通常含有堿性快型 MLC的亞型MLC1f與不同比例的M LC3f及調(diào)控MLC的異構(gòu)體MLC2f。然而,IIA型纖維通常也包含慢型MLC的亞型。我們應(yīng)用解剖法結(jié)合電生理、SDH酶組化和SDS-PAGE電泳[1-2],以生后各年齡組大鼠快肌代表脛前肌和慢肌代表比目魚肌為對象,觀察不同發(fā)育階段肌纖維改變,以期對快慢肌相互作用原理及其運動機制有所了解。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)主要儀器設(shè)備:RM6240多道生理信號系統(tǒng)(成都儀器廠);恒冷切片箱(Leica CM3000型,德國產(chǎn))、DYY-Ⅲ28C 型電泳槽(北京六一廠)、DYY605穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(南京新校園生物技術(shù)研究所)。(2)主要試劑藥品:氯化硝基四氮唑藍(lán)、琥珀酸脫氫酶(SDH)為Sigma公司產(chǎn)品,丙烯酰胺(分析純),N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(分析純),十二烷基磺酸鈉(SDS),三(羥甲基)氨基甲烷(T ris)(優(yōu)級純),2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 電生理 生后2周、6周、12周健康SD(rattus norvegicus sprague-dawley)大鼠各6只,雌雄不拘(由南通大學(xué)實驗動物中心提供),以20%氨基甲酸乙酯(烏拉糖)經(jīng)腹腔注射麻醉(1 g/kg體重),剖檢右后肢,用雙電極分別插入脛前肌和比目魚肌,肌電參數(shù)為電壓強度:0.1 V,波寬:0.2 ms,頻率:2.5 Hz,正電壓連續(xù)單刺激。

1.2.2 肌肉蛋白質(zhì)電泳 分別取出脛前肌和比目魚肌,迅速置于研缽中,加以液氮(-196℃)研磨成粉狀,加樣品緩沖液(15 mg/mL)溶解,放入高速冷凍離心機中,12 000 r/min(4℃)離心5 min,取上清。

配制4%濃縮膠和8%分離膠,適當(dāng)加入40%過硫酸銨與TEMED,依次制膠、加樣與電泳。預(yù)電泳控制電壓70～80 V,時間 30～60 min;然后電泳控制電壓150 V,時間240～300 min。接著實施銀染 、拍照 。

1.2.3 酶組化 從液氮內(nèi)取出肌條置放于恒冷切片箱(Leica CM3000型,德國產(chǎn)),在-20℃條件下切片,厚度為10 μ m。置于室溫干燥30～60 min,做琥珀酸脫氫酶(SDH)組化染色。

1.2.4 觀察計數(shù)與統(tǒng)計 在光鏡下觀察肌纖維的類型和結(jié)構(gòu)。每張切片隨機抽樣10個點,放大100倍后計數(shù)肌纖維類型,計算各型肌纖維的構(gòu)成比例。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行雙因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠各年齡組脛前肌和比目魚肌肌電圖(electromyogram,EMG)分析 本試驗采用針電極分別插入脛前肌和比目魚肌,引導(dǎo)并記錄各肌電圖(見圖1,2所示)。

隨著大鼠年齡增長,肌肉動作電位圖譜也不斷變化。脛前肌和比目魚肌的肌電圖振幅隨年齡的增長,振幅都不斷增大,持續(xù)時間變長,波動也變大;將脛前肌和比目魚肌的肌電圖相比較,在同一年齡組中脛前肌肌電圖的振幅、持續(xù)時間均大于比目魚肌。2.2 大鼠脛前肌和比目魚肌肌纖維的肌球蛋白輕鏈異構(gòu)體(MyLCs)發(fā)現(xiàn)脛前肌的電泳圖譜上均可分出 5種 MyLCs,即 MyLCs 3,MyLCs 2F,MyLCs 2S,MyLCs 1F,MyLCs 1S的條帶,而比目魚肌的電泳圖譜上只能分出 4種MyLCs,即:MyLCs 2F,MyLCs 2S,MyLCs 1F,MyLCs 1S的條帶(見圖3)。同時脛前肌MLCs 3,MLCs 2F,MLCs 1F的條帶要比MLCs 2S和MLCs 1S的深,而比目魚肌MLCs 2S與MLCs 1S條帶要比MLCs 2F,MLCs 1F深,這與酶組織化學(xué)染色分型的結(jié)果相一致。

表1 生后各年齡組SD大鼠快慢肌肌電圖持續(xù)時間、波動幅度平均值

2.3 大鼠各年齡組脛前肌、比目魚肌肌纖維分布在SDH染色切片上,脛前肌的肌纖維可分為I型、IIA型、IIX(IID)型、IIB型。比目魚肌的肌纖維可分為I型、IIA 型、IIX(IID)型,沒有 IIB型 。I型肌纖維細(xì),染色深;IIA型肌纖維中等,染色淺;IIX(IID)型肌纖維最細(xì),染色最深;IIB型肌纖維最粗,染色居最淺(如圖4、5所示)。

圖3 大鼠比目魚肌和脛前肌的肌球蛋白輕鏈異構(gòu)體銀染電泳圖

圖4 生后各年齡組 SD大鼠比目魚肌的 SDH組織化學(xué)染色生后2周(左),6周(中),12周(右)(400×)

圖5 生后各年齡組SD大鼠脛前肌的SDH組織化學(xué)染色生后2周(左),6周(中),12周(右)(400×)

表2 大鼠脛前肌和比目魚肌的肌纖維構(gòu)成比例%,n=6)

表2 大鼠脛前肌和比目魚肌的肌纖維構(gòu)成比例%,n=6)

注:P＜0.05,差異顯著

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從表2看出,大鼠脛前肌纖維構(gòu)成比例在生后發(fā)育生長過程中IIB型和IIA型較多,并且IIB型和IIX型肌纖維構(gòu)成比例隨大鼠年齡增長而增加。而比目魚肌I型和IIA型纖維構(gòu)成比例較高,這可能和比目魚肌是后肢重要的維持姿勢肌有關(guān)。

3 討論

3.1 肌電圖圖譜分析 從圖1、2中看出,大鼠脛前肌、比目魚肌在生后不同年齡階段接受刺激后所產(chǎn)生的動作電位,幼年的波形簡單平穩(wěn);隨著年齡的增加,刺激產(chǎn)生的動作電位波動逐漸變得復(fù)雜、持續(xù)的時間和頻率也較幼年的長,并且12周齡大鼠的棘波清晰可見。重要的是,比目魚肌動作電位波形比脛前肌的棘波更為復(fù)雜。由此可以看出,生后發(fā)育過程中大鼠比目魚肌在穩(wěn)定體位和調(diào)控運動中姿勢與關(guān)節(jié)角度,并選擇精致細(xì)微動作。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)脛前肌作為主動肌疲勞而足背屈運動終止后,其拮抗肌比目魚肌并沒有立即恢復(fù),仍然低于運動前水平[3]。3.2 肌球蛋白輕鏈異構(gòu)體的多樣性 成年哺乳動物骨骼肌中肌球蛋白輕鏈異構(gòu)體(myosin light chain,MyLCs)可以分為6種,即存在于快肌纖維中的MyLCs1f、MyLCs2f以及 MyLCs3f和存在于慢肌纖維中的MyLCs1s、MyLCs2s,還有1種胚胎期MyLCs[4]。我們試驗中發(fā)現(xiàn)脛前肌的電泳圖譜上均可分出 5種 MyLCs,即 MyLCs3,MyLCs2F,MyLCs2S,MyLCs1F,MyLCs1S的條帶;而比目魚肌的電泳圖譜上只可分出 4種 MyLCs,即:MyLCs2F,MyLCs2S,MyLCs1F,MyLCs1S的條帶,沒有MyLCs3。研究證實,在無壓力狀態(tài)下肌纖維的收縮率與MyLCs3的高含量有關(guān),單個個體肌纖維在MyLCs表達(dá)上的異質(zhì)性和MyHCs含量的不同導(dǎo)致肌纖維收縮功能的很大差異。

3.3 肌纖維分布特征 Pette等[5]根據(jù)肌球蛋白酶組化分類法將肌纖維分為四型:I(SO)型肌纖維收縮速度慢,肌纖維內(nèi)琥珀酸脫氫酶活性高,有利于動物維持平衡和姿勢;IIX(FO)型肌纖維收縮速度快,易發(fā)動而不易疲勞,保持張力和維持姿勢的穩(wěn)定;IIA(FOG)型肌纖維收縮速度相對較快,適合持久快速運動;IIB(FG)型肌纖維收縮時以糖無氧酵解代謝供能為主,易疲勞,產(chǎn)生暴發(fā)性短時高張力快速運動[6]。在比目魚肌切片中未發(fā)現(xiàn)有IIB型肌纖維,并且 I型肌纖維47.9%±3.4%～72.3%±6.3%構(gòu)成比例要明顯高于IIA型22.5%±2.5%～38.8%±3.7%和IIX型5.2%±1.7%～13.3%±3.1%纖維,并隨年齡逐漸增多,也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脛前肌 I型12.9%±2.3%～20.7%±3.6%纖維,充分說明該肌在小腿三頭肌穩(wěn)定后肢過程中,首先募集I型慢縮氧化肌纖維增加肌力以抵抗重力;而在脛前肌內(nèi)IIB型41.5%±7.4%～53.7%±8.3%纖維構(gòu)成隨年齡增長,實施無氧酵解高速運動維持后肢的協(xié)調(diào)運動。

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