汪志慧，孫智達*，謝筆鈞

響應曲面法優(yōu)化雙酶法提取蓮房原花青素

汪志慧，孫智達*，謝筆鈞

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070)

利用Box-Behnken中心組合試驗設計及響應面(RSM)分析，研究雙酶法提取蓮房原花青素(LSPC)的浸提條件對原花青素提取率的影響，利用SAS軟件對蓮房原花青素提取率的二次回歸模型進行分析。結果表明：雙酶法提取蓮房原花青素的最佳工藝參數(shù)為酶解溫度53℃、酶解時間1.6h、pH4.8、果膠酶:纖維素酶=1:1.1，在此工藝參數(shù)下原花青素的提取率為5.20%，優(yōu)化后的工藝相對單一乙醇提取法提取率的3.84%，有明顯的提高。采用DPPH法進行抗氧化性的對比，結果顯示雙酶法提取的蓮房原花青素比單一醇法提取的原花青素的清除DPPH自由基的能力強。因此，由Box-Behnken響應曲面法優(yōu)化所得的雙酶法提取工藝可為蓮房原花青素的工業(yè)提取提供參考和依據(jù)。

蓮房；原花青素；酶解；提取率；中心組合設計；響應面

蓮房是蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)的成熟花托，又名蓮蓬殼(lotus seedpod，LS)，具有消瘀、止血、去濕的功效[1]。現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)蓮房中含有的主要活性生理物質(zhì)為原花青素，原花青素是至今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的自由基清除劑之一[2]，具有增強免疫力、保護心血管、預防高血壓、抗腫瘤、抗輻射、抗突變及美容等作用[3-6]。由于它廣泛的生理活性及出色的安全性，在食品化妝品及醫(yī)藥領域具有廣闊的前景[7-8]。

目前，原花青素的提取方法有水溶劑提取法、有機溶劑提取法、微波提取法、超聲提取法、超臨界流體萃取法等[9-13]，生物酶法提取植物中的原花青素是在傳統(tǒng)的溶劑提取方法的基礎上，根據(jù)植物細胞壁的構成，利用酶的反應所具有的高度專一性等特點，選擇相應的酶，將細胞壁的組成成分水解或降解，破壞細胞壁結構，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸于溶劑中，從而達到提高原花青素提取率的目的[14-17]，而蓮房中的原花青素幾乎被以纖維素和果膠為主要構成的蓮房細胞壁所包圍，因此本實驗選用纖維素酶和果膠酶對蓮房進行酶解，基于以上原理建立了雙酶法提取蓮房原花青素的工藝，以期得到較高的提取率。

響應曲面法(response surface methodology，RSM)采用合理的試驗設計，能以經(jīng)濟的方式，用較少的試驗數(shù)量和時間對試驗進行全面研究，不僅可以建立連續(xù)變量曲面模型，對因素及其交互作用也可以進行評價，可以有效快速地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件[17]。RSM雖然廣泛用于眾多過程優(yōu)化控制等領域[18-20]，但關于蓮房原花青素雙酶法提取工藝條件的優(yōu)化未見報道。本實驗采用RSM法，以蓮房原花青素提取率為考察指標，對影響蓮房原花青素提取提取率的一些關鍵因素進行研究，探求酶法提取蓮房原花青素的最佳工藝條件，以便于對蓮房資源進一步開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮房采自武漢市湯遜湖，品種為武植2號；葡萄籽原花青素標準品(純度95%) 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；纖維素酶(10000U/g) 北京奧博星生物技術有限責任公司；果膠酶(30000U/g) 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；DPPH自由基 美國Sigma公司；香草醛、濃硫酸、甲醇、乙醇均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FuheHH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；RE-111型旋轉蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；SH2-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；UV-9100紫外-可見分光光度計 北京瑞利公司；電子天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素雙酶法提取

新鮮蓮房經(jīng)粉碎后，準確稱取10g，加入雙酶(果膠酶-纖維素酶)進行酶解反應，酶解時溶液的體積為50mL，然后用乙醇提取，提取溫度55℃，乙醇體積分數(shù)65%，提取時間120min。抽濾得提取液，在50℃條件下用旋轉蒸發(fā)儀將乙醇蒸出，定容至100mL測定蓮房原花青素提取率。

1.3.2 原花青素單一醇提取法提取率

新鮮蓮房經(jīng)粉碎后，準確稱取10g，用100mL體積分數(shù)65%乙醇溶液55℃浸提120min，抽濾得提取液，在50℃條件下用旋轉蒸發(fā)儀將乙醇蒸出，定容至100mL測定單一醇提法的蓮房原花青素提取率。

1.3.3 原花青素提取率的測定

1.3.4 單因素及響應曲面法試驗設計和統(tǒng)計分析

單因素影響試驗主要考慮酶解溫度、酶解pH值、酶解時間以及加酶量等因素原花青素提取率的影響。響應曲面法試驗設計采用Box-Behnken模型，以酶解溫度、酶解pH值、酶解時間以及加酶比例(果膠酶:纖維素酶)為主要考察因素(自變量)，分別用X1、X2、X3、X4表示，按方程：Xi=(xj—x0)/Δx對自變量進行編碼，其中，Xi為自變量的編碼值，xj為自變量的真實值，x0為試驗中心點處自變量的真實值，Δx為自變量的變化步長[15]。并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，因素編碼及各自變量水平見表1。

采用SAS9.0對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程可以表達為：

式中：Y為響應值(蓮房原花青素提取率)；A0為常數(shù)項；Ai為線性系數(shù)；Aii為二次項系數(shù)；Aij為交互項系數(shù)；Xi、Xj(i≠j)為自變量編碼值。

表1 雙酶法提取蓮房原花青素響應面試驗因素水平及編碼Table 1 Coded values and corresponding actual values of factors in CCD design

1.3.5 清除二苯三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)的IC50值及清除率的計算

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，通過在515nm波長處檢測雙酶法和單一醇法提取的蓮房原花青素對DPPH自由基的清除效果，計算其抗氧化能力，并計算出自由基清除率為50%時自由基清除劑質(zhì)量濃度，即IC50(半數(shù)抑制率質(zhì)量濃度)。

取不同稀釋度的提取液2mL和2×10-4mol/L DPPH自由基甲醇溶液2mL，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫避光反應30min后于515nm處測其吸光度，并用VC溶液作為陽性對照，計算兩種方法提取的原花青素對DPPH自由基的清除率[22]，公式如下：

式中：A0為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

2 結果與分析

2.1 響應曲面法試驗設計及結果

單因素試驗結果顯示：酶解溫度55℃、酶解pH5.0、酶解時間1.5h、纖維素酶和果膠酶的加酶比為1:1時蓮房原花青素有最大的提取率。蓮房原花青素提取的響應曲面實驗設計方案與試驗結果見表2，按照1.3.4節(jié)對酶解溫度、酶解pH值、酶解時間以及加酶比作變換，以蓮房原花青素提取率為響應值(Y)，共27個試驗點，其中24個為析因點，3個為中心點試驗進行了3次，以估計誤差。

表2 蓮房原花青素提取試驗設計與結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding results

利用SAS 9.0統(tǒng)計軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得蓮房原花青素提取率(模型)的二次多元回歸方程：Y= 5.25-0.069167X1＋0.3025X4-0.12125X12＋ 0.13X1X3＋0.1X1X4-0.15X22-0.1575X32-0.12X3X4-0.76125X42。

2.2 模型的顯著性檢驗

從回歸模型方差分析(表3)可見，試驗選用的模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著P=0.270194＞0.05，說明模型是合適的；模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.9575，說明該模型能解釋95.75%響應值的變化，僅有總變異大約4.25%不能用該模型來解釋；相關系數(shù)R2=0.9804，說明該模型擬合程度良好，預測值與實測值之間有較好的相關性，試驗誤差小，可以用該模型來分析和預測蓮房原花青素的提取率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model for the extraction yield of procyanidins

表4 二次多項式回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結果Table 4 Significance test of each regression coefficient of the regression model for the extraction yield of procyanidins

圖1為蓮房原花青素提取率(Y)實測值相對回歸方程預測值的偏離情況對照圖例。在設定的27組試驗中最小響應值為4.00，最大值為5.33；預測值與實測值之間的最大偏差為：

即最大偏差為8.47%。從這一方面說明采用響應曲面法進行雙酶法提取蓮房原花青素的試驗設計所得回歸方程(模型)是可行的。

圖1 實測值與模型預測值對照圖Fig.1 Plot of model-predicted values against experimental values of the extraction yield of procyanidins

由表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知，在此試驗設計中，一次項X1顯著，X4極顯著(P＜0.01)，二次項X1X3、X1X4、X3X4顯著(P＜0.05)，X12、X22、X32、X42極顯著(P＜0.01)，其余項均不顯著。

2.3 響應面交互作用分析

回歸模型的響應曲面及其等高線見圖2，3組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。由三組圖對比可知，加酶比(X4)對蓮房原花青素提取率影響最為顯著，表現(xiàn)為圖2B、2C的曲面較陡。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[23]。由圖2B、2C等高線可以看出，酶解溫度和加酶比以及酶解pH值和加酶比的交互作用顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。相比較而言，酶解溫度和酶解pH值之間的交互作用稍弱。

圖2 各因素交互作用的響應面與等高線圖Fig.2 Response surface of the pairwise interactive effects of various hydrolysis conditions on the extraction yield of procyanidins

2.4 最優(yōu)提取條件

通過采用SAS軟件的Rsreg回歸分析語句編寫對試驗模型進行典型性分析，以獲得最大蓮房原花青素提取率時的提取條件，經(jīng)典型性分析得：在X1=-0.38624、X2=0.10911、X3=-0.33626、X4=0.20036(即蓮房原花青素提取的最佳條件為酶解溫度53.07℃、酶解時間1.56h、pH4.8、果膠酶:纖維素酶=1:1.08)條件下，蓮房原花青素提取的理論值達到5.30%?？紤]到實際操作的便利，將蓮房原花青素的提取工藝條件優(yōu)化為酶解溫度53℃、酶解時間1.6h、pH4.8、果膠酶:纖維素酶=1:1.1，此條件下，蓮房原花青素提取的理論值達到5.24%。

2.5 試驗模型的驗證和比較

設定提取次數(shù)為3次，對模型得到的最優(yōu)條件和考慮過實際操作的便利性后得到的最終條件進行驗證實驗。實驗結果表明，模型得到的最優(yōu)條件下的實際提取率為(5.28±0.02)%，考慮過實際操作的便利性后得到的最終條件下的實際提取率為(5.20±0.03)%，均與理論最大值非常接近，說明模型可以較好的反映出蓮房原花青素提取的條件，從而也說明了用響應面法對蓮房原花青素提取條件參數(shù)進行優(yōu)化是可行的。

2.6 雙酶法與單一醇提法對蓮房原花青素的提取率的對比

比較雙酶法與醇提法提取蓮房原花青素，由實驗測得單一乙醇提取法蓮房原花青素的提取率為(3.84±0.02)%，雙酶法提取率為(5.20±0.03)%，兩者比較，雙酶法提取率明顯較高。

2.7 雙酶法與單一醇提法提取的原花青素清除DPPH自由基能力的比較

圖3 蓮房原花青素清除DPPH自由基的能力Fig.3 Comparison on DPPH radical scavenging activity of lotus seed pod procyanidins extracted by different methods

按照1.3.5節(jié)方法，測得兩種不同方法提取的原花青素和VC在波長515nm處的吸光度。如圖3可以看出，兩種不同方法提取的原花青素提取液及VC溶液都有較強的清除DPPH自由基的能力，并且隨著溶液質(zhì)量濃度的增加，清除率也逐漸增加。雙酶法提取的蓮房原花青素的IC50為6.66mg/L，單一醇法和VC的IC50分別為7.43、9.07mg/L，表明雙酶法提取的蓮房原花青素較之單一醇法提取的蓮房原花青素有著較強的抗氧化能力。

3 結 論

采用Box-Behnken的中心組合設計及響應面(RSM)分析，建立蓮房原花青素提取的二次多項式數(shù)學模型。經(jīng)檢驗證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預測蓮房原花青素提取率。利用模型的響應面及其等高線，對影響原花青素提取率的關鍵因素及其相互作用進行探討，通過典型分析并考慮到實際操作的便利性得到的最終優(yōu)化工藝參數(shù)為酶解溫度53℃、酶解時間1.6h、pH4.8、果膠酶:纖維素酶=1:1.1。在此條件下進行驗證實驗所得蓮房原花青素提取率為5.20%，對比乙醇提取法3.84%的提取率，雙酶法具有明顯高的提取率。且雙酶法提取的蓮房原花青素清除DPPH自由基的能力強于單一乙醇提取法的蓮房原花青素。因此，利用響應面分析方法對雙酶法提取蓮房原花青素工藝進行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進一步的工業(yè)化提取奠定基礎，以便于對蓮房資源進一步開發(fā)利用。

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Optimization of the Double-enzymatic Extraction of Procyanidins from Lotus Seed Pods Using Response Surface Methodology

WANG Zhi-hui，SUN Zhi-da*，XIE Bi-jun
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

A process for extracting procyanidins from lotus seed pods consisting of simultaneous double-enzymatic hydrolysis with pectinase and cellulose and subsequent extraction with 65% aqueous ethanol solution was proposed in this study. Central composite design (CCD) coupled with response surface methodology (RSM) was used to investigate the optimization of the double-enzymatic hydrolysis of lotus seed pods for improved procyanidin extraction. A mathematical predictive model for the extraction yield of procyanidins was established based on the experimental data from CCD design, and analyzed using SAS software. The results showed that the optimal technological conditions for the hydrolysis of lotus seed pods were as follows: hydrolysis temperature, 53 ℃; hydrolysis time, 1.6 h; initial hydrolysis pH, 4.8; and the ratio of pectinase to cellulose, 1: 1.1, and the yield of procyanidins was 5.20% after hydrolysis under these conditions followed by 120 min extraction at 55 ℃with 65% aqueous ethanol solution, 35.7% higher than that of single ethanol extraction. In addition, procyanidins extracted by the method had stronger ability to scavenge DPPH radicals than those derived from single ethanol extraction.

lotus seed pod；procyanidins；enzymatic hydrolysis；extraction rate；central composite design；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)04-0064-05

2010-03-29

國家“863”計劃項目(2007AA100401)

汪志慧(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：wangzhihui100@yahoo.cn

*通信作者：孫智達(1963—)，男，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學。E-mail：sunzhida@mail.hzau.edu.cn