豆興堂 ，宋先忱，郭 丹 ，張興會(huì)

（1.遼寧省遼寧絨山羊原種場(chǎng)有限公司,遼陽(yáng) 111000；2.遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼陽(yáng) 111000）

自然情況下，成年母羊不經(jīng)激素處理，活體采卵僅能獲得3.6～6.6枚可用卵母細(xì)胞［1］，經(jīng)生殖激素處理每次能獲得10～20枚［2］，而每只幼齡羔羊在生殖激素誘導(dǎo)卵泡發(fā)育下平均每次可獲得80～120枚可用卵母細(xì)胞［3］。因此，如果將幼羔超排技術(shù)與羊體外受精技術(shù)、胚胎移植技術(shù)進(jìn)行組裝集成（juvenile in vitro embryo transfer，JIVET），運(yùn)用于養(yǎng)羊生產(chǎn)，可將羊的繁殖效率較常規(guī)胚胎移植提高約20倍，較自然繁殖提高約60倍，并使世代間隔縮短到正常的1/3～1/4，這將充分挖掘和利用優(yōu)良母羊的早期繁殖潛力，大大加快羊育種及品種改良進(jìn)程，同時(shí)也將解決羊胚胎移植商業(yè)化所需胚胎來(lái)源匱乏及胚胎生產(chǎn)成本昂貴的問題，將大大促進(jìn)胚胎生產(chǎn)的商業(yè)化應(yīng)用，應(yīng)用前景十分廣闊。本試驗(yàn)利用4～8周齡遼寧絨山羊母羔，進(jìn)行超排、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)、體外受精等研究，期望建立絨山羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料 4～8周齡遼寧絨山羊母羔羊。隔離飼養(yǎng)于遼寧省畜牧科學(xué)院內(nèi)，母羔與大母羊同群舍飼，主要飼喂苜蓿草、羊草，補(bǔ)飼羔羊顆粒料、鹽磚等，自由飲水。

1.2 主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱：HERA Cell 150，美國(guó)；立體顯微鏡：Minitube，德國(guó)；倒置顯微鏡：LEICA DMI 3 000 B，德國(guó)；電子天平：十萬(wàn)分之一克，北京賽多利斯天平公司。

1.3 主要試劑 FSH：批號(hào)R9D19A；LH：批號(hào)R8K03VB；均為加拿大產(chǎn)。PMSG：寧波激素廠；Heparin：Bioszune；EGS：采集發(fā)情遼寧絨山羊母羊血液，56℃滅活30 min，0.22 μm 濾過；TCM199、E2、N-EAA、EAA，Sigma；超純水：Milli-Q純水儀制；其余試劑均為Sigma產(chǎn)。

1.4 母羔超排采集卵母細(xì)胞 最后一次超排注射12～14 h后采集卵母細(xì)胞，常規(guī)手術(shù)法暴露卵巢，用10mL注射器逐一刺破卵泡抽取卵泡液及卵母細(xì)胞。應(yīng)注意抽吸力量要輕。采卵液為：TCM-HCO3+10 ug/mL Heparin+5%EGS+2.2 mg/mL Na-pyrunate+0.146 mg/mL L-Glutamine+2.383 mg/mL HEPES+2.603 mg/mL HEPES-Na+10 μL/mL青鏈霉素。

1.5 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng) 采集的卵母細(xì)胞液在37℃40倍立體顯微鏡下，用撿卵針撿取卵母細(xì)胞。在采卵液、成熟培養(yǎng)液中各洗3遍，挑選A（卵丘細(xì)胞3層以上，胞質(zhì)均勻）、B（1～2層卵丘細(xì)胞，胞質(zhì)均勻）級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)。用四孔板培養(yǎng)，每孔600 μL成熟液，上覆礦物油，38.5℃、5%CO2預(yù)先平衡2 h以上。將洗過的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入四孔板，每孔30～35枚卵母細(xì)胞在38.5℃、5%CO2下進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)24～26 h。

1.6 體外受精 精子獲能處理：將自制細(xì)管凍精，放入38～40℃水浴解凍，檢查活力。取100～200 μL精液輕輕加入到裝有600～800 μL獲能液（添加20 μg/mL肝素的SOF液，培養(yǎng)箱中平衡2 h以上）試管底部，將試管放入CO2培養(yǎng)箱，精子上游獲能處理20～30 min。

卵母細(xì)胞處理：將成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞從成熟培養(yǎng)液中移出，轉(zhuǎn)入1%透明質(zhì)酸酶的受精液中作用1～2 min，輕輕吹打，去掉顆粒細(xì)胞；在受精液中洗滌3次，再將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有受精液的四孔板（每孔400 μL受精液，上覆礦物油，培養(yǎng)箱中平衡2 h以上）中，每孔25～30枚卵母細(xì)胞，準(zhǔn)備受精。

精卵體外受精：輕輕吸取上游獲能處理試管內(nèi)液體的上清液，在立體顯微鏡下，輕輕加入到含有卵母細(xì)胞的四孔板中，每孔100～150 μL上清液，加入時(shí)注意避免形成氣泡。做好記錄，將四孔板放入CO2培養(yǎng)箱，精卵受精作用 22～24 h。

1.7 早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng) 精卵受精作用后，輕輕吹打卵母細(xì)胞去掉粘附的精子，將假定合子在SOF-HCO3+BSA等發(fā)育液中洗滌3～5次，移入600 μL發(fā)育液四孔板培養(yǎng)孔中，每孔 25～30 枚，38.5 ℃、5%CO2、5%O2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察卵裂情況，移出棄掉單細(xì)胞卵，統(tǒng)計(jì)卵裂率，做好記錄。其余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換SOF-HCO3+10%EGS等發(fā)育液繼續(xù)培養(yǎng)，每48 h更換1/2新鮮培養(yǎng)液。4～5 d后觀察囊胚發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.8 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.8.1 不同超排方法對(duì)超排效果、胚胎發(fā)育的影響 將12只母羔隨機(jī)分成2組。Ⅰ組用PMSG+FSH超排處理，即先肌肉注射PMSG 400 u，以后間隔12 h分別肌肉注射FSH 40 mg 3次；Ⅱ組用FSH+PMSG超排處理，即先間隔12h分別肌肉注射FSH3次，最后再肌肉注射PMSG400u。用SOF-HCO3培養(yǎng)系做受精、發(fā)育培養(yǎng)。

1.8.2 成熟液添加EGF對(duì)卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育的影響 用PMSG+FSH法超排母羔，2種成熟液進(jìn)行成熟培養(yǎng)，將成熟后的卵母細(xì)胞用0.5%的透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細(xì)胞，在體視顯微鏡下用吸胚管反復(fù)撥動(dòng)卵母細(xì)胞，觀察是否排出第一極體，統(tǒng)計(jì)極體率。

TCM-HCO3+10 μg/mL FSH+10 μg/mL LH+1 μg/mL E2+10%EGS+2.2 mg/mL Na-pyrunate+0.146 mg/mL LGlutamine+0.012 mg/mL cysteine+10 μL/mL 青鏈霉素，為對(duì)照組。EGF組：對(duì)照組+20 ng/mL EGF。用SOF-HCO3培養(yǎng)系做受精、發(fā)育培養(yǎng)。

1.8.3 兩種受精體系卵裂率、囊胚率比較 用PMSG+FSH法超排母羔，用添加EGF的成熟液成熟培養(yǎng)，分別用TALP液、SOF-HCO3液體外受精，Ⅰ組：用SOF-HCO3+20 μg/mL Heparin等做精子獲能處理液，SOF-HCO3+BSA等做受精、發(fā)育培養(yǎng)。Ⅱ組：用sperm-mTyrode液做精子洗滌液，fert-mTyrode+20 μg/mL Heparin等液做精子獲能、受精，SOF-HCO3+BSA等做發(fā)育培養(yǎng)。比較2組卵裂率、囊胚率。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析處理：采用SPSS 13.0軟件“Independent-Samples T Test”對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超排方法對(duì)卵母細(xì)胞數(shù)、卵裂率、囊胚率的影響 由表1可知，2種超排方法獲得的卵母細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），但卵裂率和囊胚率均有極顯著差異（P＜0.01）。

表1 不同超排方法對(duì)超排效果、胚胎發(fā)育的影響

2.2 添加EGF對(duì)卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育的影響 由表2可見，添加EGF組成熟率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），卵裂率差異不顯著（P＞0.05），但囊胚率差異顯著（P＜0.05）。見圖1～4。

表2 添加EGF對(duì)卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育的影響

圖1 母羔超排卵巢

圖2 卵母細(xì)胞（第一極體）400×

圖3 2～4細(xì)胞胚胎200×

圖4 囊胚100×

2.3 兩種受精體系對(duì)胚胎發(fā)育的影響 由表3可見，SOF受精體系卵裂率顯著高于TALP（P＜0.05），囊胚率極顯著高于 TALP（P＜0.01）。

表3 受精體系對(duì)胚胎發(fā)育的影響

3 討論

幼羔超排效果除了易受羔羊年齡、個(gè)體差異等影響外，超排方法對(duì)超排效果影響也較大。劉東軍［4］等對(duì)2～4月齡羔山羊用FSH、FSH+LH（靜脈注射）和FSH+LH（肌肉注射）3種方法進(jìn)行超排處理，分別平均回收16.0、20.3和15.0枚卵母細(xì)胞。成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精、體外發(fā)育培養(yǎng)后其2～4細(xì)胞胚胎的發(fā)生率分別為5.6%、6.7%和31.7%。張鎖鏈［5］等以FSH或FSH-LH 4種不同處理方法對(duì)29只68～110日齡羔山羊進(jìn)行超排處理，結(jié)果共采集卵泡卵母細(xì)胞708枚，平均每只羔羊采卵24.4枚。分別用經(jīng)鈣離子載體A-23178或肝素進(jìn)行獲能處理的精子對(duì)體外培養(yǎng)成熟的卵子進(jìn)行體外受精，結(jié)果精子穿入卵率分別為54.8%和34.4%，發(fā)育至2～4細(xì)胞胚的卵裂率分別為28.6%和41.9%。PMSG是糖蛋白激素中唯一獨(dú)特的促性腺激素，同一分子中具有黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）2種促性腺激素的活性，由于PMSG在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期較長(zhǎng)，同一分子又具有FSH和LH的雙重活性，在動(dòng)物體內(nèi)，其生理作用是對(duì)卵巢和睪丸的靶細(xì)胞受體，特異性極強(qiáng)。母羔超排中，大多數(shù)都是在最后注射PMSG。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，先注射PMSG組卵母細(xì)胞卵裂率、囊胚率極顯著高于后注射PMSG組，可能與后注射PMSG作用時(shí)間短、卵母細(xì)胞成熟度不夠，尤其胞質(zhì)蛋白合成儲(chǔ)存不足有關(guān)，還需進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

EGF（epidermal growth factor），上皮生長(zhǎng)因子，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，是由53個(gè)氨基組成的活細(xì)胞，由刺激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之酪氨酸磷酸化，達(dá)到修補(bǔ)增生肌膚表層細(xì)胞，其最大特點(diǎn)是能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，從而以新生的細(xì)胞代替衰老和死亡的細(xì)胞。王艾平［6］等在卵母細(xì)胞成熟液中添加EGF，結(jié)果含50 ng/mL EGF（表皮生長(zhǎng)因子）組COCs成熟率（75.45%～75.80%）和卵裂率（72.4%～74.1%）均顯著高于其它組。表明EGF對(duì)COCs體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用。劉丑生［7］等在綿羊卵母細(xì)胞成熟液中添加EGF，結(jié)果為50 ng/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%，顯著高于對(duì)照組和10、20、30、40 ng/mL組（P＜0.05）。國(guó)外較多采用TALP液研究性成熟前山羊卵母細(xì)胞的體外受精，用添加了50 μg/mL肝素的mDM液獲能，用添加1 μg/mL亞牛磺酸的TALP液受精［8］。張鎖鏈等采集種公羊新鮮精液，以0.5 μMA 23187處理1 min或在培養(yǎng)液中添加50 μg/mL肝素獲能，用2 mM咖啡因、20 μg/mL BSA的 BO液作受精液，2～4細(xì)胞胚的卵裂率分別為28.6%和41.9%。趙宏遠(yuǎn)［9］采集超排母山羊羔卵母細(xì)胞，成熟培養(yǎng)后用SOF液受精，受精培養(yǎng)23～26 h組，平均卵裂率為48.33%。PMSG+FSH超排、卵母細(xì)胞成熟液添加20 ng/mL EGF、SOF基礎(chǔ)液作受精液、胚胎發(fā)育液較適合絨山羊母羔體外胚胎生產(chǎn)，如何進(jìn)一步提高效率還需進(jìn)一步探索。

［1］Shirazi A，Shams-Eafandabadi N，Hosseini S M.A comparison of two recovery methods of ovine oocytes for in vitro maturation［J］.Small Ruminant Research，2005，58：283-286.

［2］Koeman J，Keefer C L，Baldassarre H，et al.Developmental competence of prepubertal and adult goat oocytes cultured in semi-defined media following laparoscopic recovery［J］.Theriogenology，2003，60：879-889.

［3］Kelly J M，David O，Simon K，et al.Enhanced efficiency in the production of offspring from 4 to 8-week-old lambs［J］.Theriogenology，2005，63：1876-1890.

［4］劉東軍，張鎖鏈，王建國(guó)，等.不同超數(shù)排卵方法所獲羔山羊卵母細(xì)胞體外成熟率及體外受精率的比較［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1996，27（5）：422-427.

［5］張鎖鏈，劉東軍，廛洪武，等.羔山羊的超數(shù)排卵及體外受精［J］.內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1994，25（2）：205-208.

［6］王艾平，魏泓，孫新民，等.表皮生長(zhǎng)因子、巰基乙醇和亞硫磺酸對(duì)山羊體外胚胎生產(chǎn)的影響研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2005，25（1）：3-6.

［7］劉丑生，陸會(huì)寧，張利平，等.EGF和IGF-I對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外成熟和卵裂的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（5）：588-593.

［8］武建朝.利用性成熟前山羊卵母細(xì)胞體外生產(chǎn)胚胎的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［9］趙宏遠(yuǎn).影響山羊幼羔卵泡發(fā)育及體外受精效果主要因素的研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.