吳限，陳鵬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

神經(jīng)元對缺血性損害的敏感性不一，細胞凋亡是一個動態(tài)的發(fā)展過程，在局灶性腦缺血急性期，神經(jīng)元壞死與凋亡并存，細胞壞死位于缺血中心區(qū)，細胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血半暗帶，而在腦缺血的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期，則主要表現(xiàn)為細胞凋亡［1］。近年來研究表明，細胞凋亡的過程受多種基因的調(diào)控，其中Bcl－2和p53被認為是抑制和促進細胞凋亡最重要的調(diào)控基因。我們觀察了心腦通絡(luò)液對局灶性腦缺血大鼠凋亡基因Bcl－2、p53的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供。

1.1.2 藥物 心腦通絡(luò)液:由黃芪、地龍、桃仁、紅花、當歸尾、赤芍、川芎、太子參、水蛭、菟絲子等組成，水煎后分別濃縮成濃度為0.54ml/ml和0.27ml/ml的藥液。步長腦心通(咸陽步長制藥有限公司，每粒0.4g，用生理鹽水溶解成濃度為0.033g/ml的藥液)。

1.1.3 試劑及儀器 Bcl－2試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);p53試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(日本BX60);病理圖像數(shù)碼分析系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團Med6.0)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 動物隨機分為5組，即假手術(shù)組、模型組、心腦通絡(luò)液高劑量組(簡稱高劑量組)、心腦通絡(luò)液低劑量組(簡稱低劑量組)、步長腦心通對照組(簡稱對照組)，在造模成功12h后各取8只。高、低劑量組和腦心通組分別于術(shù)前5天至處死前每天給予灌胃給藥，劑量分別為:高劑量組5.40ml/kg，低劑量組2.70ml/kg，對照組0.33g/kg。假手術(shù)組、模型組則予同等體積的0.9%生理鹽水灌胃，1日1次。

1.2.2 模型建立 采用線栓法制備大腦中動脈局灶性腦缺血模型，大鼠腹腔內(nèi)注射20%烏拉坦(6ml/Kg)麻醉后，仰臥固定，頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總及頸內(nèi)、外動脈，并在頸內(nèi)外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，右側(cè)頸總動脈剪口，插入頭端燒成圓鈍形直徑為0.25mm的尼龍魚線，進線長度約(18.5±0.5)mm，在大腦中動脈起始端堵塞大腦中動脈，然后將頸總動脈連同尼龍魚線一起結(jié)扎，慶大霉素消毒后逐層縫合切口，外用甲硝唑粉以預(yù)防感染。放回籠內(nèi)，單籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍魚線。選擇蘇醒后左上肢屈曲、行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的大鼠為栓堵成功者進行實驗，否則視為栓堵失敗，棄之不用。手術(shù)過程中保持大鼠體溫在36.5～37.5℃，于造模成功后 6h、12h、24h、48h分批檢測 IL－8、TNF－α、SOD、NO 含量的變化。

1.2.3 檢測指標及方法

在造模成功12h后，按試劑盒說明書檢測Bcl－2及p53。

使用病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色切片進行分析。在200倍鏡下每組隨機取8張片，每張片4個視野，經(jīng)顯微鏡攝像儀攝入，按512×512像素分布，并保存在病理圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，用組化分析進行分析，先進行分割，選擇點狀分割將陽性物標記為棕黃色，除去非特異染色，記錄陽性目標總面積和統(tǒng)計場總面積的比值(面密度)，進行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心腦通絡(luò)液對腦梗塞大鼠腦組織Bcl－2的影響

結(jié)果見表1。

表1 藥物對腦梗塞大鼠腦組織Bcl－2的影響(±s)

表1 藥物對腦梗塞大鼠腦組織Bcl－2的影響(±s)

注:與同點模型組比較，*P﹤0.05;與同點模型組比較，＊＊P﹤0.01;治療組與同點假手術(shù)組比較，△△P﹤0.01;高低劑量組與同點對照組比較，##P﹤0.01。

假手術(shù)組 8 24.54 ±3.20*模型組 8 33.48 ±6.12對照組 8 42.10 ±4.44△△低劑量組 8 55.44±11.38＊＊△△##高劑量組 8 81.35 ±13.65＊＊△△##

結(jié)果表明，與模型組比較，腦梗塞12h，假手術(shù)組Bcl－2陽性細胞總面積與統(tǒng)計場面積的比值最小，有顯著性差異(P＜0.05);給予心腦通絡(luò)液后，腦組織Bcl－2陽性細胞總面積與統(tǒng)計場面積的比值均有不同程度升高，且有顯著性差異(P＜0.01)，以高劑量組降低最為顯著(見圖1，2)。

圖1 Bcl－2模型組200×

圖2 Bcl－2高劑量組200×

2.2 心腦通絡(luò)液對腦梗塞大鼠腦組織p53的影響結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，與模型組比較，局灶性腦缺血12h時，假手術(shù)組p53陽性細胞總面積與統(tǒng)計場面積的比值最小，有顯著性差異(P＜0.01);給予心腦通絡(luò)液后，腦組織p53陽性細胞總面積與統(tǒng)計場面積的比值均有不同程度降低，且有顯著性差異(P＜0.01)，以高劑量組降低最為顯著(見圖3，4)。

表2 藥物對腦梗塞大鼠腦組織p53的影響(±s)

表2 藥物對腦梗塞大鼠腦組織p53的影響(±s)

注:與模型組比較，＊＊P﹤0.01;治療組與假手術(shù)組比較，△△P﹤0.01;高低劑量組與對照組比較，##P﹤0.01。

假手術(shù)組 8 22.15 ±3.49＊＊模型組 8 65.09 ±5.13對照組 8 42.69±4.62＊＊△△低劑量組 8 32.65 ±4.06＊＊△△##高劑量組 8 31.03±4.41＊＊△△##

圖3 p53模型組200×

圖4 p53高劑量組200×

3 討論

心腦通絡(luò)液是根據(jù)傳統(tǒng)的中醫(yī)理論，在總結(jié)歷代醫(yī)家治療中風病經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年臨床實踐研制的治療腦梗死的有效方劑。該方針對氣虛血瘀，腦絡(luò)閉阻的這一病機特點，采用“補益氣血、活血化瘀”為主要治法，治療上遵循“補虛瀉實、攻補兼施”的原則，已廣泛應(yīng)用于臨床多年，療效確切。本實驗結(jié)果顯示，與模型組相比，給予心腦通絡(luò)液后，腦組織Bcl－2陽性細胞總面積與統(tǒng)計場面積的比值均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，以高劑量組降低最為顯著。腦組織p53陽性細胞總面積與統(tǒng)計場面積的比值均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，以高劑量組升高最為顯著。表明心腦通絡(luò)液可促進局灶性腦缺血大鼠腦組織Bcl－2蛋白表達，抑制p53蛋白表達，通過調(diào)整凋亡相關(guān)基因的表達，抑制神經(jīng)元凋亡。

［1］孫世曉，劉泓雨，楊春壯，等.電針對局灶性腦缺血大鼠半暗帶神經(jīng)細胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bcl－2、Bax、c－Fos蛋白表達的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(1):65－68.