周曉艷,陳燕芬,崔步云,陳澤良,姜 海,趙鴻雁,樸東日,李蘭玉,王金桃

2.中國疾病預(yù)防控制中心,傳染病預(yù)防控制所布魯氏菌病室,北京 102206;

3.軍事醫(yī)學科學院疾病預(yù)防控制所,北京 100071

多位點序列分型(Multiple locus sequence typing,MLST)是一種通過對多個(一般為7個)管家基因的測序,用核苷酸序列變異來發(fā)現(xiàn)細菌型別差異的分型方法[1]。該方法在實驗過程的可操作性及實驗結(jié)果的可靠性之間取得了平衡[2]。由于其結(jié)果明確,在不同的實驗室之間具有良好的可比性[3],因此被廣泛的應(yīng)用于細菌的分型研究,并且對于某些菌株具有良好的分辨能力[4]。

布魯氏菌病(brucellosis,布病)是由布魯氏菌(brucella,布氏菌)屬的細菌侵入機體,引起的傳染—變態(tài)反應(yīng)性的人獸共患病。近年來,我國人間布病的發(fā)病數(shù)逐年遞增,已遠遠超過歷史最高水平。病原學監(jiān)測研究顯示,近年在我國引起人發(fā)病的布氏菌主要是羊種3型,為了進一步了解該型布氏菌的遺傳特征,以及與其它型之間的關(guān)系,我們選取了分離自我國不同省份的47株羊3型布氏菌,進行了MLST分型,研究其遺傳多態(tài)性。將其ST型與國外菌株的ST型進行比較,從而了解與國外菌株間的遺傳進化關(guān)系,嘗試解釋近年愈演愈烈的國內(nèi)布病疫情。

1 材料與方法

1.1 布魯氏菌菌株 收集2004-2009年分離自我國的47株羊種3型布氏菌。菌株由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所布魯氏菌病室分離、收集、鑒定和保存。

1.2 細菌培養(yǎng)與基因組DNA的提取 從菌種庫中取出凍干布氏菌株,無菌操作打開菌種管,加入布魯氏菌肉湯0.5mL使凍干物溶解。取0.1mL溶解物均勻涂布于布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基上,同時接種于布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)48h。經(jīng)純培養(yǎng)、血清凝集、噬菌體裂解、三勝黃素凝集鑒定復(fù)核后收集菌體,用熱滅活的方式滅活細菌,然后用基因組提取試劑盒(天根生物,北京)提取基因組DNA,基因組的提取按試劑盒說明書進行。提取的基因組DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增 參考文獻選擇7個管家基因(dnaK 、gyrB 、trpE、aroA 、cobQ 、gap、glk)、1 個外膜蛋白基因(omp25)和 1個基因間區(qū)int-hyp作為MLST的靶標基因[5],并合成相應(yīng)的引物。選取的靶標基因、引物、序列及擴增長度如表1所示。PCR的反應(yīng)體系(50μL):DNA1μL、引物(10μmol/L)2μL、TaqDNA 聚合酶(2.5U/μL)0.25μL、10×Taqbuffer(Mg2+1.5mol/L)5μL 、dNTPs(2.5 mmol/L)4μL、去離子水:38μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5min;94℃變性30s,63℃退火30s,72延伸1min,30個循環(huán);72℃延伸10min。

表1 MLST靶標基因、引物序列與擴增產(chǎn)物大小Table1 Oligonucleotidesequencesusedfortheamplificationandsequencingofninegeneticloci

1.4 PCR產(chǎn)物檢測與測序 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析,檢測擴增是否特異或成功,擴增特異產(chǎn)物直接用于測序。PCR產(chǎn)物純化后,用擴增引物進行雙向測序,測序由擎科測序公司進行。

1.5 序列分析 整理每株菌各個基因的測序結(jié)果,編輯序列,使序列長度范圍與文獻中給出的序列一致。將測定序列分別與相應(yīng)基因的等位基因型的序列進行比較,明確序列是否與某個等位基因型的序列一致,如果一致,則定義為某個等位基因型,否則定義為一個新的等位基因型。利用MLST在線工具(http://pubmlst.org/perl/mlstanalyse/mlstanalyse.=pubmlst)NRDB、SplitsTree、LIAN、BURST、Treedrawing等工具,對序列的等位基因型、序列型分離、連鎖平衡、聚類、進化樹等進行分析,確定序列型、探討菌株間的進化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 ST28型的鑒定 47株菌中的28株與已知的ST8型的各等位基因型是一致。另外 19株菌的omp25基因與已有的等位基因型不同,被定義為1個新的等位基因型,即ST28,見表2。

表顯示ST28與ST8有1個位點(omp25)的差異,其中ST8的omp25等位基因型為8型,而ST28的omp25等位基因型不屬于國外發(fā)現(xiàn)的已知的10個等位基因型,本研究我們將其定義為等位基因型11,而ST型也在原有的27型的基礎(chǔ)上,命名為ST28型。

表2 28個ST型的各等位基因譜Table2 28ST-typeallelesspectrum

2.2 47株菌的ST型分型地域分布 本研究中47株菌經(jīng)經(jīng)典方法鑒定為布氏菌屬羊種3型。ST分型數(shù)據(jù)分析顯示,其中19株分離自山西、陜西、廣東、河北、湖南的菌株,其omp25基因與已知的等位基因型不同,為等位基因11型,ST分型為ST28型,它們均為2008、2009年新分離到的菌株;分離自遼寧的28株菌所有的等位基因型與ST8的各等位基因型一致,表明這些菌株屬于ST8型,它們分離自 2004-2008 年,分別為 11、4、3、7、3 株。

2.3 不同基因位點的多態(tài)性 用LIAN連鎖分析工具,對ST型的等位基因型進行了連鎖不平衡分析顯示,VD為4.8308,VE為 1.8175,SIA為 0.2072。9個位點的平均遺傳多態(tài)性(H)為 0.6999+/-0.0318。9個位點即 Gap、aroA 、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、omp25和int-hyp的遺傳多態(tài)性分別為0.6878、0.7063、0.836、0.627、0.5291 、0.6878、0.7434、0.8254和 0.6561。

遺傳多態(tài)性反映不同基因位點的多態(tài)性變異程度,數(shù)值介于0～1,數(shù)值愈大,其變異度越大。各位點多態(tài)性分析顯示,glk和omp25的變異度最大,這兩個位點的等位基因型均為10,遠遠高于其它幾個位點,因此,菌株的多態(tài)性將主要來自于這兩個位點。我們本次鑒定的新ST28型,就是來自omp25的差異。

2.4 對ST28采取的不同的分析方法 為了進一步分析ST28型的特點,對所有已鑒定的ST型進行了分離分析。利用Splits tree工具,對ST型的數(shù)據(jù)進行分裂分解分析(Split decomposition analysis),從圖1中可以看出,ST28與其它幾個均屬于羊種布氏菌的 ST型聚在一起,與 ST8、ST9、ST11高度同源,只有1個等位基因om p25的差異。它們均由ST12分離而來。與其它種的布氏菌相比,羊種菌的這幾個ST型是聚集在一起的,說明羊種布魯氏菌在基因水平上是高度保守的。

圖1 不同ST型間的Splits TreeFig.1 Splits Treeofdifferent ST-type

對不同ST型間的進化關(guān)系采用neighbor joinning計算方法進行分析,各個ST型間的進化關(guān)系如圖2所示。羊種布氏菌的幾個ST型處于同一個進化分支上,且高度集中,說明羊種布氏菌是一種高度進化,且變異度小的一種布氏菌。ST28型與ST8、ST9遺傳關(guān)系很近,處于同一個進化層次。

圖2 不同ST型間的進化關(guān)系Fig.2 Differentevolutionary relationships between ST-type

BURST(Based U pon Related Sequence Type)是一種基于相關(guān)序列型的分型方法,用于根據(jù)細菌的等位基因型譜將細菌分為不同的群,計算每個序列型的單個位點變異數(shù) SLV(Single Locus Variants)、雙位點變異數(shù)(DLV)和衛(wèi)星數(shù),鑒定可能的祖先序列型等。利用BURST分析28個ST型。布氏菌的28個ST型之間,除了少數(shù)的幾個有聯(lián)系之外,更多的ST型是散在存在的。這一方面提示,布氏菌的ST型太少,難分析出不同型間的變異關(guān)系,另一方面也表明,布氏菌是一個高度保守的細菌,ST型變異小。

3 討 論

布氏菌分子流行病學研究,對了解布氏菌的菌株遺傳變遷,流行株的形成等具有重要意義。多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)作為一種準確的分子分型方法于1998年問世以來[6],以其高分辨率[7],可重復(fù)性好,可積累等[8]優(yōu)勢而得到廣泛關(guān)注。隨著測序速度的提高,數(shù)據(jù)庫積累快速增長,在病源微生物分類方面的優(yōu)勢突顯。通過對多個管家基因的測序結(jié)果,用核苷酸序列變異來發(fā)現(xiàn)細菌型別差異的分型方法[9],廣泛用于研究細菌的流行病學、群體生物學、致病性和進化[10],成為分子流行病學研究新方法。

布氏菌是一個基因組較為保守的細菌,國內(nèi)外對分型作過很多研究。崔步云等用REP-PCR、PFGE以及脂肪酸分型等方法作種屬分類[11-13],姜海等用MLVA將31株羊3型布氏菌分為了9個基因型[14]。而將MLST分型用于中國分離的布魯氏菌尚未見報道。與其它細菌的ST型相比,布氏菌的ST型相對較少,Ad rian[5]等分析了160株分離自英國、美國、愛爾蘭、法國、新西蘭等(不包括中國)約30個國家的160株菌,共發(fā)現(xiàn)了27個ST型。我們以此對2004至2008年分離自中國遼寧、山西、陜西、河北、廣州、湖南菌株為材料進行檢測,發(fā)現(xiàn)遼寧菌株與國外的ST8羊種菌一致;而其余省份菌株為1個新的ST型,我們命名為ST28,該型主要是來自om p25的堿基變化,該型國內(nèi)外均未見報道。

近年來,我國流行的布氏菌主要是羊種和牛種菌,患布病羊是我國人間布病最主要的傳染源,近年致病菌主要是羊種3型布氏菌。近5年我室從患者體液分離獲得357株布氏菌,羊種菌占99%,羊種3型有277株。一般羊種3型對人、畜均有較強的毒力和侵襲力,且致病力也較強,易引起布病的暴發(fā)和流行,且疫情重?；颊咧饕R床表現(xiàn)為長期發(fā)熱、出汗、乏力和關(guān)節(jié)疼痛等[15]。布病是自然疫源性的疾病,本次研究結(jié)果中,2004-2008年分離自遼寧的28株均為ST8,國外分離菌株也有ST8型,分析可能是當?shù)刈鳛橐咴吹乇Ａ艉驮诋數(shù)亓餍幸鸢l(fā)病的菌株。而山西、陜西、廣州、湖南、河北 5省 2008、2009年分離的菌株為同一型別,即新發(fā)現(xiàn)的ST28,分析原因為近年國內(nèi)傳染源流動,引起國內(nèi)布病流行的主要菌株,它們可能是我國布病的主要傳染源。

本研究中,我們選取的菌株數(shù)量有限,僅涉及近年主要引起人感染的部分菌株;對我國流行情況的分析具有一定的局限性。在后續(xù)的研究中,我們將選取更多種型、不同年代和地區(qū)的菌株進行更為全面的研究,并完善中國布氏菌株MLST數(shù)據(jù)庫。

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