劉文權(quán),江麗芳,劉 巖,江漢寧,湯云霞,方丹云

2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,廣州 510089

登革病毒(Deng ue virus ,DENV)包含4個(gè)血清型(DENV-1,DENV-2,DENV-3和 D ENV-4),屬于黃病毒科、黃病毒屬[1]。DENV感染人體后,可引起登革熱(dengue fever,DF)和登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF)/登革休克綜合癥(dengue shock syndrome,DSS)[1-2]。根據(jù) WHO統(tǒng)計(jì),全世界每年約有 5千萬(wàn) ～1億的人感染DENV,其中約近7萬(wàn)的人因感染DENV而死亡,大多是15歲以下的兒童[3-4]。目前,世界上尚無(wú)可有效預(yù)防登革熱的疫苗和相應(yīng)的治療藥物。

黃病毒的基因組為單股正鏈RNA,分子量約為11kb[5]。病毒基因組 RNA編碼核蛋白(capsid,C)、膜蛋白(membrane,prM/M)、包膜蛋白(envelope,E)3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2a,NS2b,NS3,NS4a,NS4b,NS5)[5-6]。其中,prM蛋白在和E蛋白是構(gòu)成病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中組裝成非感染性的未成熟病毒顆粒[6]。在宿主細(xì)胞的弗林蛋白酶(furin)的作用下,prM被切割為pr和M蛋白,并引發(fā)病毒顆粒表面的E蛋白發(fā)生重排,產(chǎn)生含 M蛋白的病毒顆粒[5-7]。

黃病毒的包膜E蛋白與prM蛋白在體外表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)時(shí),可折疊為類似病毒粒子的正確的空間結(jié)構(gòu)的多聚體顆粒-病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)也稱作亞病毒顆粒(subviral particles,SVPs)[8]。通過(guò)cryo-EM分析TBEV病毒樣顆粒的分子結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)VLPs含有60個(gè)E蛋白組成的二聚體,呈二十面體結(jié)構(gòu),顆粒的直徑為30nm左右[8]。Schalich等通過(guò)對(duì)TBEV的VLP理化特性和生物學(xué)活性進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)VLPs不僅含有與病毒粒子類似的雙層脂膜和E蛋白二聚體的表面排列,而且具有相似的prM和E蛋白的加工和糖基化修飾,甚至連抗原的表位也一致[9]。VLPs同樣具有類似成熟病毒顆粒的一些生物學(xué)活性方面,如VLPs能在低 pH條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,具有HA活性以及與細(xì)胞膜的融合活性等[9]。

我們利用組成型表達(dá)的畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)登革2型病毒的prM和E蛋白,并利用透射電鏡技術(shù)對(duì)病毒樣顆粒在酵母細(xì)胞內(nèi)的組裝特性進(jìn)行了初步分析,為研制登革病毒樣顆粒疫苗的基礎(chǔ),同時(shí),病毒樣顆粒也將為研究登革病毒的組裝機(jī)制和生物學(xué)活性提供一個(gè)很好的模型。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞株 登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株由本實(shí)驗(yàn)室分離并測(cè)定其全基因組序列,提交GenBank,登錄號(hào)為EF051521。

1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌(E.Coli)DH5α和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)宿主GS115均由本實(shí)驗(yàn)室保存。畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZαA為Invitrogen公司產(chǎn)品,含組成型表達(dá)啟動(dòng)子GAP,釀酒酵母α-factor分泌信號(hào)肽編碼序列,以及作為選擇標(biāo)記的編碼Zeocin抗生素的抗性基因。

1.3 酶、生化試劑及抗體 逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse T ranscriptase),EXTaq酶和各種限制性內(nèi)切酶均為大連寶生物工程(Takara)公司產(chǎn)品。TRIzol和Zeocin抗生素為Invitrogen公司的產(chǎn)品?？沟歉?型E蛋白的單克隆抗體(3H5-1)購(gòu)自美國(guó)ATCC。鼠源抗登革2型病毒血清由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 擴(kuò)增含prM信號(hào)肽序列的包膜蛋白基因(SprME)的上游引物為DY1(5′-GACTTCGAAAATGAACATCT TGAACAGGAG-3′),斜體字部分為Bsp119Ⅰ酶切位點(diǎn),下劃線部分代表ATG起始密碼子。下游引物為 DY2(5′-GAATCT AGATCAGGCCTGCACCATGACTC-3′)斜體字部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn),下劃線部分代表終止密碼子。所有引物均在Primer Premier 5軟件上設(shè)計(jì),由廣州英駿公司合成。

1.4.2 登革病毒 RNA的抽提與RT-PCR 將DENV-2 ZS01/01病毒株接種C6/36細(xì)胞單層上,加入含2%滅活小牛血清的MEM培養(yǎng)液,于37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞病變?yōu)?“+++”,收集上清進(jìn)行RNA的制備。RNA的制備的具體方法參照T RIzol抽提試劑盒的說(shuō)明書。然后以RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增目的基因,具體操作步驟為:在一無(wú) RNA酶的EP管中加入模板 RNA(5～10 μ g),2 μ L 下游引物(DY2),2 μ L dNTPs(100mmol/L)和3 μ L DEPC水,將上述成分混勻并在 65℃水浴 5 min,迅速在冰上預(yù)冷2 min以上。加入 4 μ L 5×PrimeScript Buffer,1 μ L RNase Inhibitor(40 U/μ L),0.5 μ L Reverse Transcriptase(200 U/μ L)。將上述溶液混勻,在 PCR儀上42℃保溫 30 min,70℃15 min;然后將PCR管置于冰上冷卻,得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性1 min,55℃退火45 s,72℃延伸2 min,循環(huán) 30次,再在 72 ℃延伸10 min。

1.4.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將獲得的目的基因SprM和穿梭質(zhì)粒pGAPZαA分別用Bsp119 I和Xba I進(jìn)行酶切,并利用E.Z.N.A凝膠回收試劑盒回收所需的基因片段。將酶切回收后的基因片段與pGAPZαA載體在 T4 DNA Ligase的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)含Zeocin抗生素的 Low Salt LB平板(25 μ g/mL)的篩選獲得轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆菌落。利用E.N.Z.A質(zhì)粒抽提試劑盒抽提陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR,酶切和測(cè)序鑒定。

1.4.4 畢赤酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)、鑒定 利用Bgl II酶對(duì)重組質(zhì)粒pGAPZA-SprME進(jìn)行線性化處理,取100 μ L制備好的畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞,與10 μ g線性化的DNA混合,轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的0.2 cm的電轉(zhuǎn)化杯中,冰浴5 min,在Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化,電脈沖參數(shù)為電壓1500 V,5 ms。取200 μ L轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別鋪在含有100 μ g/mL Zeocin的YPD平板上,放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d至平板長(zhǎng)出乳白的酵母轉(zhuǎn)化菌落。

挑取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的含有pGAPZASprME質(zhì)粒的酵母菌轉(zhuǎn)化子分別接種于3 mL YPD液體培養(yǎng)基(100μ g/mL Zeocin)中,30℃,250 r/min的條件下有氧振蕩培養(yǎng)12 h。然后按1∶100的比例將菌液接種至100 mL新鮮的YPD發(fā)酵培養(yǎng)液中,30℃下,振蕩培養(yǎng),每隔12 h取出1mL菌液4℃條件下,10 000 r/min離心,分別收集上清和菌體。取80 μ L上清與20 μ L 5×上樣buffer混合,20 μ L裂解后的菌體與等量的2×上樣buffer混合,在沸水中水浴 10 min。樣品冷卻后,進(jìn)行 SDSPAGE,每個(gè)樣品加入兩塊膠相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣孔。每個(gè)點(diǎn)樣孔加30 μ L樣品,在120 V電壓下電泳2 h左右。電泳結(jié)束后,將一塊膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,相同點(diǎn)樣順序的另一塊膠上的蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)。膜在含0.1%Tween-20和5%脫脂奶粉的TBS中4℃封閉過(guò)夜,然后加入適當(dāng)稀釋的抗E單抗(3H5-1)或者抗DENV-2血清,室溫反應(yīng)4h。用含0.1%Tween-20的TBS洗膜3次,每次10～15 min。然后加入1∶2 000稀釋的H RP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗溶液。室溫輕輕振蕩溫育2h。用TBST洗膜3次。最后加入DAB溶液顯色。

1.4.6 病毒樣顆粒的純化 取5mL的酵母菌體,加入預(yù)冷的 1mL Breaking Buffer(50 mmol/L NaH2PO4,1 mmol/L PMSF,1 mmol/L EDTA,5%glycerol,pH 7.4)加入酸洗玻璃珠(Sigma)冰浴條件下裂解細(xì)胞。裂解液在4℃條件下,12 000 g離心10 min。將裂解液上清移至含5%～50%的蔗糖梯度溶液的上層,在4℃153 000 g的條件下離心6 h(HATICHI,P80AT轉(zhuǎn)子)。離心結(jié)束后,取絮狀病毒樣顆粒層進(jìn)行電鏡檢測(cè)。

1.4.7 電鏡檢測(cè) 細(xì)胞透射電鏡觀察:將培養(yǎng)72h的酵母發(fā)酵液,2 000 r/min離心5 min,收集菌體。小心的加入前固定液,切勿沖散管底的菌體。然后送中山大學(xué)電鏡室進(jìn)行包埋,切片等程序,將樣品進(jìn)行電鏡觀察(Philips CM10電子顯微鏡,工作電壓40 kV),并拍照。

免疫電鏡觀察:取90 μ L蔗糖密度梯度離心后的病毒樣顆粒,用PBS稀釋10倍。加入1∶100稀釋的特異性抗DENV-2病毒血清0.1 mL充分混合。置37℃作用1h,后再置4℃過(guò)夜。以17 000 r/min,離心60 min。吸去上清,將離心管口倒置于濾紙上,吸去殘留液體,沉淀物中加少量H2O混懸,用2%磷鎢酸 (pH7.2)負(fù)染1～2 min,滴加于 400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上,用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負(fù)染液。將樣品進(jìn)行電鏡觀察(Philips CM10電子顯微鏡,工作電壓40 kV),并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 包膜蛋白基因RT-PCR結(jié)果 以DENV-2 ZS01/01株病毒的RNΑ為模板,利用下游引物DY2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到cDNΑ。然后以cDNΑ為模板用上下游引物DY1/DY2擴(kuò)增SprME片段,PCR產(chǎn)物的大小約為2 250 bp,與預(yù)期的分子量相符,見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增SprME基因1:SprME基因;2:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)ⅦFig.1 PCR amplication of SprME genes1:SprME;2:DNA markerⅦ

2.2 pGΑ PZΑ-SprME重組載體的構(gòu)建和鑒定將獲得的SprME基因片段通過(guò)內(nèi)切酶Bsp119 I和Xba I的作用插入pGΑ PZα Α載體的多克隆位點(diǎn),然后在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)Zeocin抗生素篩選后,進(jìn)行 PCR鑒定,利用載體通用引物 5'pGAP Foward/3'AOX I進(jìn)行擴(kuò)增,可見(jiàn)一條大小約為2 300 bp的片段,空載體 pGΑ PZα Α擴(kuò)增出來(lái)的片段大小約為530 bp(圖2A);利用基因特異的上下游引物DY1/DY2檢測(cè),可擴(kuò)增出一條大小約為2 250 bp的片段,而空載體未擴(kuò)增出特異性條帶(圖2B)。最后通過(guò)測(cè)序表明含prM/E基因的重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 包膜蛋白的表達(dá)和鑒定 將重組質(zhì)粒pGΑ PZΑ-SprME電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,通過(guò)抗生素Zeocin篩選和PCR鑒定后,進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。收集不同時(shí)間段的發(fā)酵上清上清分別進(jìn)行SDSPΑ GE電泳和Western blot檢測(cè)。免疫印跡結(jié)果顯示檢測(cè)52kDa的蛋白可與DENV-2 E單抗特異結(jié)合,表明該蛋白就是酵母菌分泌表達(dá)的DENV-2 E蛋白(圖3A);利用抗DENV-2血清孵育后,除檢測(cè)到52kDa的E蛋白條帶外,還在約20kDa的位置檢測(cè)到prM蛋白帶(圖3B)。利用凝膠掃描系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn),E蛋白的分泌表達(dá)量占總蛋白含量的23%左右,見(jiàn)圖4。

2.4 細(xì)胞透射電鏡 用細(xì)胞透射電鏡觀察表達(dá)病毒樣顆粒的重組酵母菌超微結(jié)構(gòu)。在酵母細(xì)胞的胞漿中形成了一個(gè)大雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu),大的囊泡中被同樣由雙層膜結(jié)構(gòu)組成的小室間隔,小室里分布著大量的直徑為50-100nm的空泡(vesicle packets,VP)。在小室里的聚集30-50nm的病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)以散狀或晶格狀排列(圖5A)。當(dāng)囊泡的外膜破裂后,那些包裹在小室里面的病毒顆粒便被釋放到細(xì)胞漿,見(jiàn)圖5B。

2.5 免疫電鏡觀察VLPs 經(jīng)蔗糖密度梯度超速離心后,吸取絮狀的病毒樣顆粒,進(jìn)行免疫電鏡觀察。在抗DENV-2血清的作用下發(fā)生聚集,顆粒的形態(tài)為規(guī)則的球形,直徑約為30-50 nm,見(jiàn)圖6。

3 討 論

病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)是指由病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組裝成的,不含病毒核酸,不能進(jìn)行自主復(fù)制的空心顆粒[10]。VLPs不包含病毒DNA或RNA,因此不存在毒力的回復(fù)和同源重組的隱患[10]。同時(shí),VLPs保留了與天然病毒粒子相同或類似的空間構(gòu)型和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位,具有很強(qiáng)的免疫原性。不但能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫,而且可以激發(fā)CD4+T細(xì)胞的增殖和CT L反應(yīng)[10]。常用的表達(dá)VLPs的系統(tǒng)有桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),酵母表達(dá)系統(tǒng),哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和腺病毒表達(dá)系統(tǒng)等[10]。其中,釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的HBcAg VLPs和四價(jià)人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)VLPs疫苗已經(jīng)通過(guò)FDA認(rèn)證。

黃病毒樣顆粒的形成離不開(kāi)E蛋白的正確折疊,以及prM和E的相互作用[8-9]。黃病毒的prM信號(hào)肽位于在C蛋白的C末端的疏水的區(qū)域,發(fā)揮引導(dǎo)prM進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[7]。通過(guò)對(duì)共表達(dá)黃病毒的prM和E基因發(fā)現(xiàn),在prM的N端引入prM信號(hào)肽能有效的引導(dǎo)E蛋白以VLPs的形式分泌到上清中[11]。我們通過(guò)生物信息學(xué)軟件Singal IP對(duì)DENV-2 ZS01/01的C蛋白的C末端進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),prM的信號(hào)肽序列位于C蛋白的C末端的20-25個(gè)氨基酸殘基序列。并用病毒自身的prM信號(hào)肽取代了pGAPZα A載體的α信號(hào)肽,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在prM信號(hào)肽的引導(dǎo)下包膜E蛋白被高水平的分泌表達(dá)。

用組成型表達(dá)的pGAPZα A載體取代傳統(tǒng)的甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體是本研究的一大亮點(diǎn)。雖然醇氧化酶(alcohol oxidaseI,AOX I)啟動(dòng)子已被成功應(yīng)用并表達(dá)了多種外源蛋白。但使用甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)存在諸多缺陷,如外源基因的轉(zhuǎn)錄水平受到甲醇的嚴(yán)格調(diào)控和誘導(dǎo),殘留的甲醇對(duì)外源蛋白在食品和藥物應(yīng)用的影響以及發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)不間斷的添加甲醇而帶來(lái)的安全隱患等。因此,相比甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子而言,無(wú)需甲醇誘導(dǎo)的含3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP)的組成型表達(dá)啟動(dòng)子(GAP啟動(dòng)子)更具吸引力。一系列的研究證實(shí)GAP啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的組成型表達(dá)能力,能提供與AOX1啟動(dòng)子水平相當(dāng)甚至更高效率的連續(xù)性表達(dá)[12]。同時(shí),GAP啟動(dòng)子還被應(yīng)用在釀酒酵母和畢赤酵母中高水平表達(dá)了含HBsAg抗原的病毒顆粒[12]。我們的研究結(jié)果也證實(shí)GAP啟動(dòng)子具有高效的表達(dá)能力,而且在培養(yǎng)過(guò)程中不需更換碳源,發(fā)酵工藝更為簡(jiǎn)便,因此在表達(dá)DENV病毒樣顆粒疫苗方面顯示出了良好的應(yīng)用前景。

我們還利用透射電鏡對(duì)DENV-2 VLPs在酵母細(xì)胞內(nèi)的組裝特點(diǎn)進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞的DENV顆粒組裝時(shí)誘導(dǎo)了很多50～150 nm的呈圓形或橢圓形,具有雙層脂膜囊泡結(jié)構(gòu)。而這種現(xiàn)象與黃病毒在感染細(xì)胞中組裝誘導(dǎo)出來(lái)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜重排是類似的。以前的研究結(jié)果表明這些空泡結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制密切相關(guān)[13],但由于我們表達(dá)的VLPs不含核酸也無(wú)核衣殼蛋白,因此我們推斷這些誘生出來(lái)的空泡結(jié)構(gòu)與DENV病毒顆粒組裝密切相關(guān)。DENV-2 VLPs在酵母細(xì)胞中組裝特性說(shuō)明酵母這種真核細(xì)胞能提供模擬登革病毒在感染細(xì)胞中的理想的環(huán)境。該表達(dá)系統(tǒng)可以作為潛在的研究登革病毒包膜蛋白功能和病毒顆粒組裝的理想模型。免疫電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)利用酵母系統(tǒng)生產(chǎn)的DENV-2 VLPs具有免疫反應(yīng)性,利用該表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)登革病毒樣顆粒是制備登革亞單位疫苗的一個(gè)有效途徑。

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