李曉亮,張媛媛,趙 平,趙秀芹,陳 祥,焦新安,萬(wàn)康林

2.揚(yáng)州大學(xué),江蘇省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,揚(yáng)州225009;

3.北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所,北

有些諾卡菌(Nocardia)與非結(jié)核分枝桿菌(Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)或結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的肺結(jié)核病的臨床表現(xiàn)極為相似,容易造成誤診,且存在混合感染[1-3]。然而,傳統(tǒng)通過(guò)表型和生化鑒定菌種的方法耗時(shí)費(fèi)力很難滿足臨床準(zhǔn)確快速鑒定病原菌的需要?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),尤其是PCR和DNA測(cè)序技術(shù)為發(fā)展諾卡菌快速菌種鑒定技術(shù)提供了良好基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)16S rDNA基因和rpoB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后,在NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì),將表型確定為非結(jié)核分枝桿菌的BJ7臨床分離菌株確定為馬鼻疽諾卡菌(Nocardia f arcinica,N.f arcinica)。

1 材料與方法

1.1 菌株 臨床分離菌株BJ7由朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所提供,來(lái)自一擬診結(jié)核病患者痰標(biāo)本;H37Rv購(gòu)自中國(guó)生物制品藥品檢定所;均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病研究室傳代培養(yǎng)、保藏。均按給定方法接種培養(yǎng),判定結(jié)果[5]。馬鼻疽諾卡菌AY756551取自NCBI。

1.2 主要試劑 L-J培養(yǎng)基中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病研究室制備[4]、PNB/TCH分枝桿菌鑒別培養(yǎng)基購(gòu)自倍索公司。引物由上海生工合成,2xPCR-mix購(gòu)自天根公司。

1.3 DNA提取 CTAB法提取[8]菌株DNA。生理鹽水收集臨床菌株新鮮培養(yǎng)物50～100mg(濕重),用溶菌酶,10%SDS/蛋白酶K混合液及CTAB破除細(xì)胞壁,去除蛋白,脂類等物質(zhì),然后用氯仿萃取,冰乙醇洗滌 DNA沉淀,最后用TE溶解DNA沉淀,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 rpoB、16S r DNA PCR擴(kuò)增、測(cè)序分析 引物序列見(jiàn)表 1。 PCR 反 應(yīng) 體 系 為 50μ L:引 物 各 2.0μ L,PCR-mix 25μ L,樣品 DNA 5μ L,純水 16μL。rpoB PCR 和 16SrDN A PCR反應(yīng)條件相同:94℃10min;94℃ 1min,62℃ 1min,72℃1min,30次循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳40min,EB染色20min后,紫外燈下觀察結(jié)果。

1.5 DNA測(cè)序分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均由擎科公司測(cè)序。將16S rDNA測(cè)序序列與GenBank中諾卡菌16S rDNA參考序列(登錄號(hào)見(jiàn)fig.1)應(yīng)用DNASTA R軟件進(jìn)行多序列比對(duì),并用MEGA 4.0繪制生物進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)將16S rDNA和rpoB基因序列提交NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性比對(duì)。

表1 rpob,16S rDNA引物序列、目的片段、Tm值表Table 1 Premiers,product sizes and Tm of,rpoB and 16S rDNA gene

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)鑒定 BD培養(yǎng)管第7d報(bào)告陽(yáng)性。普通L-J培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)10d左右就可以生長(zhǎng)出微黃色菌落,接種鑒別培養(yǎng)基 PNB和 TCH,可見(jiàn)菌落生長(zhǎng),痰涂片抗酸染色可見(jiàn)暗紅色桿狀菌體,鑒定為非結(jié)核分枝桿菌。

2.2 rpoB和16SrDNA PCR擴(kuò)增 rpoB和16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別約360bp和1 000bp。

2.4 測(cè)序分析 對(duì)rpoB和16SrDNA PCR產(chǎn)物測(cè)序,與公共數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)作DNA序列同源性比較,結(jié)果與馬鼻疽諾卡菌的該片段相似性高,同源性分別為99%和100%,見(jiàn)表2。對(duì)16SrDNA序列與諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析,BJ7與AY756551(N.f arcinica)匹配度最高,進(jìn)化樹(shù)中與N.f arcinica親緣關(guān)系最近,見(jiàn)圖 1。

3 討 論

諾卡菌可以引起人的多種感染性疾病。對(duì)人類致病的主要有星形諾卡菌,巴西諾卡菌、豚鼠諾卡菌及鼻疽諾卡菌。其中馬鼻疽諾卡菌可以起引起人腦膿腫[10],肝臟移植感染[11],人的呼吸道和皮膚感染[12]。1888年,獸醫(yī) Edmond Nocard首先從牛身上分離出諾卡菌[14]。一年后,Trevisan研究了它的特性并命名為馬鼻疽諾卡菌(Nocardia farcinica)[13]。1975年被認(rèn)定為人類致病菌[19-20]。Valenzuela Tovar JF等人報(bào)道曾經(jīng)從結(jié)核病患者痰液中分離到12株諾卡菌[15]。西班牙學(xué)者曾報(bào)道由馬鼻疽諾卡菌引起的肺部感染[14]。據(jù)報(bào)道對(duì)甲氧芐氨嘧啶,利福平,卡那霉素等多種抗生素具有耐藥性[17-18]。鑒于馬鼻疽諾卡菌是引起人類嚴(yán)重疾病的常見(jiàn)諾卡菌,并且具有高度的耐藥性,臨床實(shí)驗(yàn)室有必要將馬鼻疽諾卡菌從諾卡菌中鑒別出來(lái)[13]。

表2 NCBI上blast比較rpoB和16SrDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物DNA序列同源性Table 2 BLASTN of test strains about rpoBand 16SrDNA on NCBI

本實(shí)驗(yàn)菌株BJ7從呼吸道擬診結(jié)核病患者痰液中分離到。通過(guò)表型和生化疑似鑒定為為非結(jié)核分枝桿菌,分子生物學(xué)鑒定是馬鼻疽諾卡菌。說(shuō)明馬鼻疽諾卡菌在生長(zhǎng)和形態(tài)上的特點(diǎn)與非結(jié)核分枝桿菌相似,臨床上肺部諾卡菌病與肺部分枝桿菌病癥狀相似,容易引起誤診,因此,準(zhǔn)確進(jìn)行菌種鑒定非常重要。病原菌傳統(tǒng)的分類、鑒定系統(tǒng)主要以形態(tài)和生理生化特征的綜合指標(biāo)為依據(jù),易受多種因素影響,鑒定結(jié)果存在著很大的異質(zhì)性,有時(shí)不可靠性不強(qiáng),而且鑒定一種菌種費(fèi)時(shí)、低效,不能難以滿足臨床需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多技術(shù)被應(yīng)用于菌種鑒定比如,如DNA測(cè)序、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism analysis,RFLP)[9]。2006年Nava,V.R[7]等人應(yīng)用hsp65-RFLP鑒定諾卡菌菌種,成功鑒定出北京諾卡菌(N.beijingensis)、馬鼻疽諾卡菌(N.f arcinica)、南非諾卡菌(N.transvalensi)等8種諾卡菌。雖然此方法現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定,但仍不能滿足實(shí)際需求,許多菌種指紋圖譜比較相近難以區(qū)分仍需要測(cè)序的方法進(jìn)行鑒定,16S rDNA直接測(cè)序仍然被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定[6,16]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)16S rDNA進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)BJ7菌株與馬鼻疽諾卡菌的親緣關(guān)系很近,將序列提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)結(jié)果BJ7與馬鼻疽諾卡菌同源相似性達(dá)到100%,rpoB基因序列比對(duì)相似性達(dá)到99%,證實(shí)BJ7為馬鼻疽諾卡菌。直接測(cè)序分析能夠?qū)⒅Z卡菌鑒定到種的水平,快速、敏感、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便。

圖1 16SrDNA序列相似性進(jìn)化樹(shù)注:進(jìn)化樹(shù)所用序列除BJ7 16SrDNA外均來(lái)自Gen Bank中的參考序列,菌株名后面的分別是菌株保藏庫(kù)編號(hào)和序列登錄號(hào)。箭頭所指方框中所標(biāo)注的是與BJ7 16S rDN A序列親緣關(guān)系比較近的菌株。Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences homologyPhylogenetic tree showing the position of BJ7 and N. farcinica (GenBank accession number AY756551)marked by arrow within other Nocardia species.The tree was based on 16S rDN A comparison(1000bp)usingthe neighbor-joining method from MEGA 5.0 software.All sequences used in phylogenetic tree were obtained from GenBank besides BJ7 and the accession numbers were presented behind the species name.

在臨床實(shí)際診斷過(guò)程中,對(duì)于那些擬診結(jié)核病的患者,若用結(jié)核分枝桿菌治療方法治療不見(jiàn)好轉(zhuǎn),可以考慮是否是諾卡菌感染,應(yīng)對(duì)病原菌進(jìn)行種的堅(jiān)定,為臨床治療提供參考。

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