伍樹松賀 喜伍小松賀建華侯德興,2*
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學飼料安全與高效利用教育部工程研究中心,長沙 410128;2.日本鹿兒島大學農(nóng)學部,日本鹿兒島 890-0065)
花青素(anthocyanidin),又稱花色素,其基本的多酚環(huán)為2-苯基-苯并毗喃陽離子[C6(A環(huán))-C3(C 環(huán))-C6(B 環(huán))]構(gòu)型(圖 1)[1]。自然條件下游離的花青素很少見,常與糖或有機酸結(jié)合形成花色苷(anthocyanin),結(jié)合的糖主要有葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等[1];結(jié)合的有機酸主要有香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、對羥基苯甲酸等芳香酸和脂肪酸[2]?;ㄉ諏兕慄S酮類化合物?;ㄇ嗨卦谥参矬w內(nèi)可以和未修飾的無色花青素在無色花青素還原酶(LNR)和花青素還原酶(ANR)的作用下生成原花青素(proanthocyanidins,PC)[3],原花青素也叫前花青素,是自然界中廣泛存在的一種多酚類聚合物,具有很強的抗氧化能力,在熱酸性條件下可分解為花青素單體?;ㄇ嗨亟Y(jié)合的取代基團不同,所形成的化合物也多種多樣,目前已知的花色苷有500多種[4],但常見的花青素只有6種[1](表1)。
花青素廣泛存在于有色水果和蔬菜中,是構(gòu)成花瓣和果實顏色的主要色素之一[5],在黑莓、藍莓、越橘、葡萄、紅莓、草莓、桑葚、黑豆、紅球甘藍、紫甘薯等蔬菜和水果中均含有較高的花青素[6]?;ㄇ嗨啬鼙粰C體快速吸收,在體內(nèi)發(fā)揮其生理功能,還能通過血腦屏障,直接保護大腦和神經(jīng)系統(tǒng)[7]。目前,花青素主要用于人的保健品,在動物飼料中的應用很少。本文就國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,總結(jié)花青素的主要生理功能及其在動物體內(nèi)的吸收與代謝途徑,探討其應用于動物飼料所能產(chǎn)生的效益和大規(guī)模利用的可行性,以期為花青素的應用提供參考。
研究指出,活性氧攻擊細胞和亞細胞膜系統(tǒng)的多烯脂肪酸會導致膜脂過氧化和膜系統(tǒng)的破壞,從而引起一系列的生理生化紊亂,并對一些生物功能性分子造成直接破壞[8]?;ㄇ嗨鼐哂泻軓姷目寡趸饔?,能清除植物細胞內(nèi)的氧自由基,從而緩解氧自由基的毒害,是一種很好的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑[9]。抗氧化是花青素最主要的生理功能,花青素的其他生理功能主要基于其抗氧化活性[10]。
國內(nèi)外許多研究表明,花青素具有很強的抗氧化作用。張俊鴿等[11]在研究中人為造成氧化損傷環(huán)境,比較PC、維生素C、維生素E提高晶狀體抗氧化損傷的能力,發(fā)現(xiàn)PC顯著優(yōu)于維生素C和維生素 E(P <0.05)。陳瑋等[12]研究表明,黑米花青素能顯著降低光照致使的大鼠視網(wǎng)膜組織中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)的產(chǎn)生(P<0.05),同時能顯著提高大鼠視網(wǎng)膜抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性(P < 0.05)。Rivero-peréz 等[13]發(fā)現(xiàn)添加矢車菊花色苷可以預防由Cu2+等金屬離子引起的抗壞血酸氧化。Howard等[14]指出,花青素通過與金屬離子螯合抑制過氧化物的反應,還可以將被氧化脫氫的抗壞血酸鹽還原成維生素C,而維生素C可使被氧化的維生素E和巰基恢復成還原型,從而起到間接的抗氧化作用。由此可見,花青素能通過清除體內(nèi)自由基、影響機體抗氧化酶的活性以及與金屬離子結(jié)合發(fā)揮其抗氧化的生理功能,還可再生維生素C、維生素E等抗氧化劑。
圖1 花青素的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of anthocyanidins
表1 存在于植物中的幾種主要的花青素Table 1 Major anthocyanidins in plants
Noda 等[15]評價了幾種主要花青素(Dp、Cy和Pg)的抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)花青素的羥基體系可與亞鐵離子結(jié)合,并且能夠清除超氧自由基。3種花青素的半數(shù)有效濃度(ID50)分別為2.4、22.0和456.0 μmol/L。同時,以上3種花青素的化合物還能抑制大鼠腦組織液的脂質(zhì)過氧化反應,ID50分別為 0.7、3.5 和85.0 μmol/L。由此可見,花青素的抗氧化能力與其B環(huán)上的羥基數(shù)有關,羥基數(shù)目越多,抗氧化能力則越強。Matsumoto等[16]研究表明,花色苷的抗氧化活性與溶液的pH以及糖苷配基(花青素)有關,當 pH 在6.0~7.0時,花色苷的活性最強;不同糖苷配基形成的花色苷中,以Dp為糖苷配基的花色苷活性最強,這與 Noda等[15]的結(jié)果一致。表2為6種主要花青素在植物可食部分的比例及各自的(水溶性維生素E當量的抗氧化能力值)TEAC[17-18]。
表2 6種主要花青素在植物可食部分的比例及其TEAC值Table 2 The distribution of six anthocyanidins in the edible parts of plants and their TEAC value
結(jié)合表1和表2可以看出,花青素的抗氧化能力隨B環(huán)上羥基數(shù)目的減少而降低,此外,B環(huán)R1和R2位上的羥基被甲氧基(OCH3)取代的花青素(Pn和Mv)比只有H的Pg抗氧化能力強,說明花青素的B環(huán)上的羥基構(gòu)象與其抗氧化能力也有著密切的關系。Dp的抗氧化活性最強,但是在植物可食部分中,Cy的含量最高,因而發(fā)揮的抗氧化作用最大。Kong等[19]研究指出矢車菊素-3-葡萄糖苷(C3G)是水果中分布最廣泛的花色苷。
花青素能明顯抑制動物結(jié)腸癌的發(fā)生,且這種抑制作用可能與花青素結(jié)構(gòu)B環(huán)上的羥基團的數(shù)量呈正相關關系。Hou等[20]用JB6小鼠表皮細胞探討花青素抑制癌癥發(fā)生的分子機制。在小鼠表皮細胞中,促癌物質(zhì)如12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)、表皮生長因子(EGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等能激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)從而激活轉(zhuǎn)錄活化蛋白(AP-1)并產(chǎn)生致癌性蛋白質(zhì),而化學預防劑能抑制AP-1的激活和致癌性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。將經(jīng)過TPA誘導處理的的小鼠上皮細胞分別置于6種花青素的0~20 μmol/L的溶液中,發(fā)現(xiàn) Dp、Cy、Pt均能顯著抑制腫瘤轉(zhuǎn)化物質(zhì)的生成和AP-1的激活,但Pn、Mv、Pg卻沒有抑制作用。這說明花青素B環(huán)上的二羥苯基結(jié)構(gòu)可能與其抗癌功能有關。研究指出,花青素能與蛋白質(zhì)結(jié)合并改變其結(jié)構(gòu),從而調(diào)節(jié)代謝途徑中的關鍵酶和蛋白活性,而且能影響氧化還原反應敏感的信號傳導途徑,改變其基因表達[21]。
研究表明,細胞凋亡在清除嚴重損傷的細胞和腫瘤細胞中發(fā)揮著重要的作用[22]。Dai等[23]從黑莓中提取花青素處理體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞HT-29,發(fā)現(xiàn)花青素在體外可明顯抑制其增殖,49.2 μg/mL的花青素作用細胞72 h的生長抑制率為66%,且抑制能力隨濃度遞增而遞增。Huynh等[24]用PC處理人體乳腺癌細胞,測得其凋亡數(shù)比未處理的同種細胞高的多,而在正常人乳腺細胞樣品中,PC并不明顯改變凋亡的數(shù)量。表明花青素能有針對性地誘導癌癥細胞的凋亡。Hou等[25]用檢測抗白血病和抗癌物質(zhì)的有效模型——人早幼粒白血病HL-60細胞來探討花青素誘導細胞凋亡的機制,當用100 μmol/L的6種不同的花青素處理HL-60細胞6 h后,發(fā)現(xiàn)Dp、Cy、Pt均能通過使細胞形態(tài)改變和DNA變性來誘導細胞凋亡,而Pn、Mv、Pg卻沒有作用。Dp誘導HL-60細胞凋亡的程度與其濃度和處理時間有關,誘導凋亡的最佳條件是100 μmol/L的 Dp處理6 h。機制分析表明Dp誘導細胞凋亡與氧化-JNK(c-Jun氨基末端激酶)信號傳導通路有關。從分子結(jié)構(gòu)上的比較可以推斷出,花青素誘導凋亡可能與其羥基的數(shù)目尤其是B環(huán)上羥基的數(shù)目及結(jié)構(gòu)有關。
根據(jù)現(xiàn)有研究報道,花青素主要的吸收部位在胃和小腸,但其吸收機制尚不明確。由于胃具有特殊的酸性環(huán)境和較小的胃黏膜吸收面積,大多數(shù)藥物在胃部吸收較差,而花青素卻可以快速吸收。Talavera等[26]以灌胃的方式給予大鼠高濃度黑莓花青素后,在大鼠胃靜脈和主動脈的血漿中觀察到黑莓花青素,且發(fā)現(xiàn)約25%的花青素單糖苷(葡萄糖苷或半乳糖苷)從胃中吸收。EI Mohsen等[27]在給予大鼠Pg 2 h后,測得其總的吸收率為18%,且大部分位于胃部。研究指出,存在于胃壁上皮細胞的一種有機陰離子轉(zhuǎn)運載體膽移位酶(bilitranslocase)可能參與這種吸收[28]。
小腸是絕大多數(shù)藥物吸收的場所。花青素多以糖苷形式存在,曾經(jīng)長期認為花色苷為親水性化合物且相對分子質(zhì)量較大,口服花色苷不能在小腸吸收,只有被下段腸道的細菌糖苷酶水解成苷元或進一步被降解轉(zhuǎn)化為酚酸后才能被吸收。最近的研究表明,花色苷具有較大的疏水性,可以通過被動擴散直接被小腸吸收。Talavera等[29]采用原位灌注大鼠空回腸法研究發(fā)現(xiàn),花色苷可直接被小腸吸收,且作為糖苷配基的花青素化學結(jié)構(gòu)對其吸收率有很大的影響。除胃和小腸的吸收外,還有大量的花青素進入直腸,因此腸道菌群在花青素的轉(zhuǎn)化和吸收中也起著重要作用。
花青素進入動物機體后,迅速被吸收、轉(zhuǎn)運和代謝,大部分可通過羥基的甲基化、與葡萄糖醛酸等有機酸結(jié)合成酯而進行代謝,還有小部分以原形排出體外。Talavera等[26]以灌胃的方式給予大鼠高濃度黑莓花青素后,對膽汁樣品進行了分析,發(fā)現(xiàn)攝入花青素20 min后,即在膽汁中觀察到花青素原形及其代謝產(chǎn)物。Frank等[30]在7位健康志愿者中研究了單體花青素在尿液中的藥物動力學。志愿者在饑餓條件下一次性服用150 mL濃縮接骨木果汁(含3.57 g總花青素),24 h尿液中的原形矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷、C3G、矢車菊素3-接骨木糖苷(C3S)和總花青素分別為攝入劑量的 0.16% 、0.06%、0.05% 和 0.06%;尿液中的低排泄率(低于1%)表明攝入的絕大多數(shù)花青素在進入循環(huán)前已經(jīng)代謝。Passamonti等[31]給麻醉的大鼠灌胃8 mg/kg純化的葡萄花青素,混合物在胃中停留了10 min,檢測發(fā)現(xiàn)不僅在血漿中[(176.4 ± 50.5)ng/mL],而 且 在 腦 中[(192.2 ±57.5)ng/g]都有花青素,表明葡萄花青素在攝入后幾分鐘內(nèi)即可到達大腦。Kalt等[7]在豬的飼料中添加藍莓粉,飼喂4周后,屠宰檢測眼、肝臟、大腦皮層和小腦等組織中是否含有花青素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在以上被檢測的組織中,均檢測出完整花青素的存在。說明花青素除常規(guī)轉(zhuǎn)運外,還可以通過血腦屏障,直接保護大腦免受自由基的損傷。
花青素作為飼料添加劑應用于飼料中,主要作用是促生長、抗炎與提高免疫力,其作用機制可能與花青素的抗氧化和清除自由基的功能有關。有研究指出,花青素對由乙醇、酸、堿所引起的胃黏膜損傷及多種試驗性胃潰瘍均有較好的保護作用,具有明顯的抗?jié)冏饔茫?2]。此外,花青素能有效促進胃腸道功能,并增加消化腺酶的分泌;促進血紅蛋白、血清蛋白的合成,即具有抗貧血和改善蛋白質(zhì)代謝的作用,從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率[33]。
國內(nèi)外有關花青素促進動物生長的研究較少,但已有報道表明,花青素對動物生長起著較好的促進作用。江立方等[34]從松針中提取PC,將其混合物添加于豬飼料中,與基礎飼糧進行對照試驗,發(fā)現(xiàn)添加300 g/t PC混合物能顯著提高豬的平均日增重(P<0.05),并降低料重比。梁衛(wèi)花[35]用添加有花青素添加劑的飼糧飼喂肉雞,與飼喂基礎飼糧的肉雞進行對照試驗,發(fā)現(xiàn)花青素能促進肉雞的生長,且二者之間差異極顯著(P <0.01)。林榮海等[33]也有類似報道,且添加花青素組平均日增重高于添加抗生素組。
Hou 等[36]評價了 5 種花青素(Dp、Cy、Pn、Mv、Pg)在小鼠巨噬細胞中抑制環(huán)氧合酶 -2(COX-2)表達的能力,發(fā)現(xiàn)Dp和Cy能顯著抑制由脂多糖(LPS)誘發(fā)的 COX-2表達(P<0.05),但Pn、Mv、Pg卻不具有抑制能力。這說明花青素B環(huán)上的正二羥苯基結(jié)構(gòu)跟這種抑制能力有關。免疫印跡法分析表明Dp能減少抑制蛋白-α(IκBα)的降解、CCAAT增強子結(jié)合蛋白 δ(C/EBPδ)和p65蛋白的核轉(zhuǎn)移以及c-Jun蛋白的磷酸化。此外,Dp還能抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化,包括JNK、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38激酶,來防止LPS誘發(fā)的COX-2表達。這說明LPS通過活化MAPK從而誘導COX-2表達,而Dp能阻礙MAPK介導的信號通路。這是首次對具有正二羥苯基結(jié)構(gòu)的花青素的抗炎分子機制做了闡述。
何穎輝等[37]在研究櫻桃花青素苷對佐劑性關節(jié)炎大鼠免疫功能和炎癥因子的影響時指出,櫻桃花青素苷對佐劑性關節(jié)炎大鼠模型的T淋巴細胞亞群和免疫功能有調(diào)節(jié)作用,并能顯著降低炎癥細胞因子白介素6(IL-6)水平,從而減輕大鼠的關節(jié)炎損傷。梁衛(wèi)花[35]研究從松針中提取出的PC對肉仔雞增重和免疫作用的影響,發(fā)現(xiàn)飼喂添加花青素飼糧組的T淋巴細胞總數(shù)大于對照組(P<0.01),而且花青素能顯著增強白細胞的吞噬功能(P<0.05)。張海暉等[38]研究蓮房原花青素對小鼠免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)PC可以提高免疫器官(胸腺、脾臟)的增長指數(shù),并且具有抗體生成能力;當PC的給藥劑量為90 mg/kg時表現(xiàn)為差異顯著(P<0.05),120 mg/kg時差異極顯著(P<0.01)。以上結(jié)果均表明,在動物飼料中添加花青素能提高動物的非特異性免疫能力,從而提高動物健康水平。
綜上所述,在動物飼料中添加花青素,能起到促生長、抗炎和提高動物免疫力的作用。但目前實證還不夠充分,無法具體闡述花青素對動物生產(chǎn)性能的影響,需要進一步重復試驗。
花青素能否大規(guī)模利用,關鍵在于其提取工藝,近年來,國內(nèi)外不少研究者對花青素的浸提參數(shù)進行反復比較,得出從不同植物中提取花青素的最佳工藝參數(shù),為花青素的提取提供了有效的參照。乙醇浸提法是國內(nèi)用的最多,也是較簡單而有效的提取方法,適合大規(guī)模提取,但提取所需時間相對較長,且花青素損耗較多。表3為不同植物花青素的乙醇浸提法最佳提取參數(shù)。
表3 花青素的浸提最佳工藝參數(shù)Table 3 Optimal processing parameters of anthocyanins extraction
從表3可以看出,提取的原材料不同,提取工藝的最佳參數(shù)也不同,這可能與各種植物中花青素的結(jié)構(gòu)不同有關。提取花青素的乙醇溶液濃度并不是越高越好,這主要因為水起著穿透植物組織細胞的作用,如果溶劑中水的含量過低,會導致花青素的滲出量降低,從而影響提取率。一般來說,溶劑的用量越大,提取量越大,但是過高的料液比會造成溶劑的浪費,并給后面的濃縮帶來困難。從理論上來看,溫度越高,分子運動速率愈快,花青素滲透、擴散、溶解速度也愈快,因而提取率愈高;但花青素極易氧化,溫度越高,花青素的酚結(jié)構(gòu)被破壞的程度越大,活性成分損失就越多,而且高溫下固體原料本身會起化學變化,從而使雜質(zhì)過多。花青素的浸提時間需要把握恰當,時間過短會造成提取不完全,時間過長則造成雜質(zhì)的增多和有效成分的損失。
花青素提取方法的改進也是提高花青素的提取率的有效途徑。近年來不少研究者發(fā)現(xiàn)了許多新的提取方法,與傳統(tǒng)方法相比,其提取率和純度均有很大提高。Lopes等[45]采用一種活性黏土(tonsil terrana 580 FF)吸附法對甘藍中的花青素進行了分離純化,與Amberlite柱層析XAD-7提取法相比,花青素的提取率提高了大約2l%。Corrales等[46]采用不同的提取方式對葡萄中花青素的提取率進行了比較研究,發(fā)現(xiàn)相同條件下,高壓(600 MPa)輔助提取或超聲波輔助提取花青素等多酚類的提取率可以比熱提取法(70℃)提高近50%,且其產(chǎn)物的抗氧化活性約為熱浸提物的3倍。Sun等[47]用微波輔助提取法,用鹽酸和乙醇的混合液做提取溶液,在1.5 mol/L的鹽酸溶液與95%的乙醇比例為15∶85的條件下,最佳提取參數(shù)為微波功率366 W,料液比1∶4,溫度55℃,提取時間12 min。
隨著我國生活水平的不斷提高,人們對動物產(chǎn)品的安全性日益重視,尤其近年屢次發(fā)生的違禁動物飼料添加劑事件,使人們談肉色變。到目前為止,尚沒有花青素給動物機體帶來有害影響或添加過量以致造成中毒的報道。由此可見,花青素作為飼料添加劑,不僅能提高動物生產(chǎn)性能,還是一類純天然、無殘留、無污染的天然產(chǎn)物添加劑,此類飼料添加劑正是未來飼料行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。此外,花青素在植物果實的皮中含量最高,而大多數(shù)植物果實的皮(如紫甘薯、茄子等)是不食用的,因此從果實的皮中提取花青素可以達到廢物利用。近期不少研究發(fā)現(xiàn)松針等來源廣泛的植物中也含有較高花青素,這為花青素的大規(guī)模使用提供了條件。進一步拓展花青素的原料來源,探明花青素在機體內(nèi)作用的分子機制,總結(jié)花青素簡單有效而成本低廉的提取方法將是決定花青素能否大規(guī)模應用的關鍵。
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