王志博 張永根辛杭書 劉 薇 夏 科

(東北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，哈爾濱 150030)

長期以來，營養(yǎng)學家一直試圖通過瘤胃的調(diào)控來提高飼糧能量和蛋白質(zhì)的利用效率，主要手段是通過控制瘤胃代謝酸中毒和瘤胃pH，增加十二指腸非降解飼料蛋白質(zhì)及微生物蛋白質(zhì)的流量，降低甲烷的排放和提供更多的葡萄糖及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，從而提高能量供應(yīng)。在反芻動物的飼糧中添加離子載體可以達到上述目的。研究表明，作為離子載體的莫能菌素能夠降低氨的產(chǎn)生量并增加瘤胃蛋白質(zhì)的流量［1－3］，短期的體外瘤胃液培養(yǎng)表明莫能菌素能夠抑制蛋白質(zhì)降解為氨［4］。

海南霉素(hainanmycin)是近年我國自行研制的聚醚類離子載體抗生素，其基本作用機理是通過改變敏感微生物細胞膜對離子的通透性，導致細菌能量代謝改變，從而影響微生物的代謝和生長。生產(chǎn)中使用的海南霉素為1%或10%海南霉素鈉預混劑，商品名為“球克”或“雞球素”，其外觀為黃色粉末［5］。近年來，海南霉素對反芻動物的影響已有一些文獻報道，其能夠降低瘤胃內(nèi)乙酸與丙酸比例及氨態(tài)氮(NH3-N)濃度［6－7］。沈贊明等［8］報道海南霉素能夠增加瘤胃肽濃度，具有節(jié)約蛋白質(zhì)的作用。但是，上述研究并未從海南霉素對瘤胃微生物影響的角度來揭示海南霉素對氮代謝影響的深層原因。因此，本試驗采用短期體外培養(yǎng)法，一方面驗證海南霉素對瘤胃發(fā)酵的影響，另一方面從參與蛋白質(zhì)分解的主要瘤胃微生物數(shù)量變化為出發(fā)點來分析肽、氨基酸、蛋白酶和脫氨酶的相關(guān)變化，從而揭示海南霉素對瘤胃氮代謝調(diào)控的機理，并以此作為海南霉素應(yīng)用在反芻動物生產(chǎn)中的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海南霉素:純度≥90%(山東勝利股份有限公司);莫能菌素:純度≥90%(美國禮來公司)。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共分6組，采用單因素試驗設(shè)計。第1組為對照組(CON)，按照正常的體外培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，不添加任何離子載體;第2組為10 mg/L莫能菌素組(MON，陽性對照);第3～6組分別為0.1、1.0、10.0 和 100.0 mg/L 海南霉素組(H0.1、H1.0、H10.0 和 H100.0)。每組設(shè) 3 個重復，體外培養(yǎng)在不同天內(nèi)重復2次。

1.3 體外培養(yǎng)

供采集瘤胃液的試驗?zāi)膛５娘暭Z(粗蛋白質(zhì)18%，中性洗滌纖維30%，酸性洗滌纖維22%)精粗比為40∶60，飼糧(干物質(zhì)基礎(chǔ))組成為60.3%的苜蓿、17.2% 的玉米粉、12.2% 的大麥粉、9.7%的大豆粉和0.6%的維生素與礦物質(zhì)預混劑。每kg維生素和礦物質(zhì)預混劑含有(干物質(zhì)基礎(chǔ)):7 mg Co，167 mg Cu，33 mg I，2 660 mg Mn，27 mg Se，4 660 mg Zn，1 000 000 IU VA，200 000 IU VD3，1 330 mg VE，267 g 尿素，67 g NaCl，33 g S和300 g MgO。此飼糧按照NRC(2001)奶牛營養(yǎng)需要進行配制。體外培養(yǎng)底物的精粗比為40∶60，除了不含上述飼糧的預混劑外，其組成與上述奶牛飼糧相同。

體外培養(yǎng)參照Tilley等［9］所述的方法進行。采集3頭裝有永久瘤胃瘺管的泌乳期的中國荷斯坦奶牛(飼喂上述飼糧)的瘤胃液，2層紗布過濾，再與碳酸鈉緩沖液1∶1混合，作為培養(yǎng)緩沖液［10］。以100 mL的玻璃注射器為培養(yǎng)管，每管內(nèi)加入50 mL緩沖液和0.5 g上述培養(yǎng)底物。在用橡膠塞密封前，通過放氣閥向每個培養(yǎng)管通入CO2。將4個不同劑量的海南霉素分別溶解于乙醇中，然后取0.2 mL添加到各自培養(yǎng)管中。將莫能菌素也溶解于乙醇中，同樣取0.2 mL添加到培養(yǎng)管中。取0.2 mL的乙醇(未溶解離子載體)添加到對照組培養(yǎng)管中。在水浴條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為39℃。

1.4 測定項目與方法

培養(yǎng)24 h后，立即測定pH。然后收集樣品用于VFA、NH3-N、肽、氨基酸、蛋白酶、脫氨酶的測定及DNA的提取。

VFA濃度采用日本島津GC－2010氣相色譜測定［11］，NH3-N 濃度采用 Broderick 等［12］所述的次氯酸鈉－苯酚法(UV－VIS8500型分光光度計，上海天美科學儀器有限公司)測定，肽和氨基酸濃度采用茚三酮顯色法測定［13］;蛋白酶和脫氨酶活性參照Siddons等［14］的方法測定，其中脫氨酶活性定義為每小時每毫升酶液釋放1 mg NH3-N的酶量為1個酶活單位，而蛋白酶活性定義為每小時每毫升酶液釋放1 mg非蛋白氮的酶量為1個酶活單位。

DNA的提取、PCR引物和PCR擴增按照Stevenson等［15］的方法進行。本試驗采用相對定量的方法對目的菌數(shù)量進行測定，其具體的方法是將目的菌和總細菌PCR擴增的Ct值進行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換，然后將目的菌轉(zhuǎn)換后的值與總細菌轉(zhuǎn)換后的值進行比較，即目的菌基因拷貝數(shù)占總細菌基因拷貝數(shù)的百分比(相對拷貝數(shù)，RPS，%)。PCR定量的微生物包括:總普雷沃氏菌(genus Prevotella)、棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、短普雷沃氏菌(Prevotella brevis)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolven)、反芻獸新月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)、埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)和嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacter amylophilus)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SAS 8.1統(tǒng)計軟件中的MIXED模型進行統(tǒng)計分析，體外培養(yǎng)不同的2天作為隨機效應(yīng)。對照組和離子載體組間的差異采用Duncan氏法進行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 海南霉素對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

海南霉素對體外培養(yǎng)瘤胃pH和VFA濃度的影響見表1。與CON相比，僅H100.0降低了總VFA濃度并提高了pH(P＜0.05);MON對pH和總VFA濃度沒有顯著影響(P ＞0.05)。H10.0、H100.0 和MON的乙酸、丁酸濃度顯著低于CON(P＜0.05)。與CON 相比，H10.0、H100.0和 MON 顯著降低了乙酸與丙酸比，并顯著提高了丙酸濃度(P＜0.05)。而H0.1 和H1.0對以上指標均無顯著影響(P ＞0.05)。

表1 海南霉素對體外培養(yǎng)瘤胃pH和VFA濃度的影響Table 1 Effects of hainanmycin on rumen pH and VFA concentration in vitro

2.2 海南霉素對體外培養(yǎng)氮代謝的影響

表2的結(jié)果表明，除了H0.1，其他海南霉素組NH3-N和氨基酸濃度顯著高于CON(P＜0.05)，MON也得到同樣的結(jié)果。與 CON相比，H10.0、H100.0和 MON 顯著提高了肽濃度(P ＜0.05)，H0.1、H1.0 對肽濃度沒有顯著影響(P ＞ 0.05)。H0.1和H1.0對蛋白酶和脫氨酶活性沒有顯著影響(P ＞0.05)，而 H10.0、H100.0 和 MON 顯著提高了蛋白酶活性且顯著降低了脫氨酶活性(P＜0.05)。

表2 海南霉素對體外培養(yǎng)NH3-N、肽和氨基酸濃度及蛋白酶和脫氨酶活性的影響Table 2 Effects of hainanmycin on concentrations of NH3-N，peptide and amino acids，and activities of protease and deaminase in vitro

2.3 海南霉素對體外瘤胃微生物蛋白質(zhì)分解菌的影響

表3列出了體外培養(yǎng)后主要參與氮代謝的微生物的RPS。與CON比，除H0.1外，其他海南霉素組顯著降低了原蟲的RPS(P＜0.05);MON也顯著降低了原蟲的 RPS(P＜0.05)。H10.0和H100.0短普雷沃氏菌和總普雷沃氏菌群的RPS顯著高于CON(P＜0.05)，而其他海南霉素組對短普雷沃氏菌和總普雷沃氏菌群的RPS沒有顯著影響(P ＞0.05)。H10.0、H100.0和 MON 的棲瘤胃普雷沃氏菌的RPS顯著高于CON(P＜0.05)。MON和所有海南霉素組對反芻獸新月形單胞菌、埃氏巨球型菌、嗜淀粉瘤胃桿菌的RPS沒有顯著影響(P ＞0.05)。除H0.1和 H1.0 外，其他海南霉素組和MON的溶纖維丁酸弧菌的RPS顯著低于CON(P ＜0.05)。

表3 海南霉素對體外培養(yǎng)參與氮代謝的主要微生物的RPS的影響Table 3 Effects of hainanmycin on RPS of primary microorganisms participating in nitrogen metabolism in vitro %

3 討論

3.1 海南霉素對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵的影響

MON顯著降低了乙酸、丁酸濃度以及乙酸與丙酸比，顯著提高了丙酸濃度，對總VFA濃度沒有顯著影響，這些結(jié)果與以前的體內(nèi)和體外的研究結(jié)果一致［16－18］，這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加莫能菌素維持總VFA濃度不變，提高丙酸濃度，降低乙酸、丁酸濃度。H10.0和H100.0高濃度的海南霉素影響了瘤胃微生物發(fā)酵，而低濃度的海南霉素對瘤胃微生物發(fā)酵沒有顯著影響，這表明海南霉素對瘤胃微生物發(fā)酵的影響與劑量有關(guān)。

H10.0和H100.0對瘤胃微生物發(fā)酵的影響與MON相似，這樣的結(jié)果與已知的海南霉素具有抗生素的活性相一致，與之前海南霉素對瘤胃發(fā)酵的影響的研究結(jié)果相似［6］。然而，H100.0使得總VFA濃度降低，對瘤胃微生物發(fā)酵有負面影響，因此對其不做進一步討論。H10.0對瘤胃微生物發(fā)酵模式的影響與MON對瘤胃微生物發(fā)酵模式的影響沒有差別，這表明海南霉素對瘤胃發(fā)酵的作用模式與莫能菌素對瘤胃發(fā)酵的作用模式相似。

3.2 海南霉素對體外培養(yǎng)氮代謝的影響及其機理

本試驗結(jié)果表明，H10.0和H100.0的原蟲數(shù)量很少，這2組的總普雷沃氏菌群和棲瘤胃普雷沃氏菌的相對數(shù)量比CON多，目前還未見海南霉素對上述2種菌數(shù)量影響的研究報道。但Weimer等［19］對莫能菌素的研究發(fā)現(xiàn)，添加莫能菌素后上述2種菌的相對數(shù)量增加，與本試驗的結(jié)果一致。而海南霉素對其他幾種參與氮代謝的細菌未產(chǎn)生顯著影響。

從本試驗結(jié)果來看，海南霉素可以減少瘤胃液中的 NH3-N濃度，這與李炯明等［7］和沈向真等［20］報道的海南霉素對NH3-N濃度的影響的結(jié)果是一致的。脫氨酶主要是由一些蛋白質(zhì)降解微生物產(chǎn)生的，其能夠?qū)Π被徇M行脫氨基，從而釋放出NH3-N。本試驗結(jié)果表明，較高濃度海南霉素顯著降低了脫氨酶活性。Ives等［21］向奶牛飼糧中添加離子載體，也得到了瘤胃液中脫氨酶活性降低的結(jié)果。有研究表明，體外培養(yǎng)條件下，添加離子載體能夠降低脫氨酶活性［22］。纖毛蟲具有較強的脫氨基作用，大多數(shù)纖毛蟲能利用蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生氨。一般而言，混合纖毛蟲的這種特殊活性是細菌的3倍［23］，在去瘤胃原蟲的情況下，瘤胃液的脫氨基活性降低，NH3-N濃度降低［24］。Jouany［25］研究表明，去原蟲的綿羊的瘤胃 NH3-N濃度比接種原蟲的綿羊的瘤胃NH3-N濃度低。本試驗的NH3-N濃度也降低了，雖然本試驗沒有去原蟲，但是添加海南霉素使纖毛蟲數(shù)量降至很低，相當于去原蟲，因此這可能是NH3-N濃度降低的原因。

瘤胃中數(shù)量最多的蛋白質(zhì)降解菌是普雷沃氏菌屬(Prevotella)的細菌，在飼喂精粗比不同的飼糧時，該屬的蛋白質(zhì)降解菌株一直存在，其總數(shù)可能占瘤胃細菌總數(shù)的60%，且具有很強的蛋白酶活性。本試驗發(fā)現(xiàn)海南霉素能夠提高瘤胃蛋白酶活性。由于普雷沃氏菌屬細菌數(shù)量增加，從而有更多的這種細菌分泌蛋白酶，因此蛋白酶活性提高。

研究發(fā)現(xiàn)，給奶牛飼喂莫能菌素降低了肽和氨基酸在瘤胃的消失速率［17］。Zinn 等［26］報道，添加莫能菌素有更多的飼料氮逃脫瘤胃降解。沈贊明等［8］的研究表明，向山羊瘤胃中灌注海南霉素可提高瘤胃中可溶性蛋白和肽濃度。本試驗中海南霉素提高了瘤胃肽和氨基酸濃度，原因是上面提到的普雷沃氏菌屬細菌的數(shù)量增加使得蛋白酶活性提高，原蟲數(shù)量減少使得脫氨酶活性降低，從而使肽和氨基酸等得以積累。

4 結(jié)論

①從對瘤胃發(fā)酵調(diào)控和增加非NH3-N流量2方面考慮，海南霉素濃度為10.0 mg/L為最適劑量。

②海南霉素對瘤胃發(fā)酵的調(diào)控模式與莫能菌素相似。

③海南霉素是通過對普雷沃氏菌屬細菌和原蟲的數(shù)量的影響來調(diào)控氮代謝。

［1］DINIUS D A，SIMPSON M E，MARSH P B.Effect of monensin fed with forage on digestion and the ruminal ecosystem of steers［J］.Journal of Animal Science，1976，42(1):229－234.

［2］HANSON T L，KLOPFENSTEIN T.Monensin，protein source and protein levels for growing steers［J］.Journal of Animal Science，1979，48(3):474－479.

［3］POOS M I，HANSON T L，KLOPFENSTEIN T J.Monensin effects on diet digestibility，ruminal protein bypass and microbial protein synthesis［J］.Journal of Animal Science，1979，48(6):1516－1524.

［4］VAN NEVEL C J，DEMEYER D I.Effect of monensin on rumen metabolism in vitro［J］.Applied and Environmental Microbiology，1977，34(3):251 －257.

［5］黃兵.離子載體抗球蟲新藥——海南霉素［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2002(5):16－18.

［6］任明強，沈贊明，趙茹茜，等.不同濃度海南霉素對山羊瘤胃消化代謝的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，1998，21(3):76 －79.

［7］李炯明，莊蘇，王恬，等.海南霉素對人工瘤胃體外發(fā)酵調(diào)控的影響［J］.家畜生態(tài)學報，2007，28(1):41－46.

［8］沈贊明，陳杰，任明強.海南霉素對山羊瘤胃內(nèi)肽的保護作用［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27(4):73－76.

［9］TILLEY J M A，TERRY R A.A two stage technique for the in vitro digestion of forage crops［J］.Grass and Forage Science，1963，18(2):104－111.

［10］MCDOUGALL E I.Studies on ruminant saliva.1.The composition and output of sheep’s saliva［J］.The Biochemical Journal，1948，43(1):99 －109.

［11］JOUANY J P.Volatile fatty acids and alcohol determination in digestive contents，silage juice，bacterial cultures and anaerobic fermentor contents［J］.Sciences des Aliments，1982，12(2):131－144.

［12］BRODERICK G A，KANG J H.Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media［J］.Journal of Dairy Science，1980，63(1):64－75.

［13］MOORE S.Amino acid analysis:aqueous dimethyl sulfoxide as solvent for the ninhydrin reaction［J］.Journal of Animal Science，1968，243(23):6281－6283.

［14］SIDDONS R C，PARADINE J.Effect of diet on protein degrading activity in the sheep rumen［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1981，32(10):973－981.

［15］STEVENSON D，WEIMER P.Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75(1):165－174.

［16］BUSQUET M，CALSAMIGLIA S，F(xiàn)ERRET A，et al.Effects of cinnamaldehyde and garlic oil on rumen microbial fermentation in a dual flow continuous culture［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(7):2508－2516.

［17］RUSSELL J B，STROBEL H J.Effects of additives on in vitro ruminal fermentation:a comparison of monensin and bacitracin，another gram-positive antibiotic［J］.Journal of Animal Science，1988，66(2):552－558.

［18］YANG C M，RUSSELL J B.The effect of monensin supplementation on ruminal ammonia accumulation in vivo and the numbers of amino acid-fermenting bacteria［J］.Journal of Animal Science，1993，71(12):3470－3476.

［19］WEIMER P J，STEVENSON D M，MERTENS D R，et al.Effect of monensin feeding and withdrawal on populations of individual bacterial species in the rumen of lactating dairy cows fed high-starch rations［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，80(1):135－145.

［20］沈向真，朱祖康，陸天水，等.海南霉素和半胱胺對水牛瘤胃消化代謝與增重的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2003(5):78－82.

［21］IVES S E，TITGEMEYER E C，NAGARAJA T G，et al.Effects of virginiamycin and monensin plus tylosin on ruminal protein metabolism in steers fed corn-based finishing diets with or without wet corn gluten feed［J］.Journal of Animal Science，2002，80(11):3005－3015.

［22］NEWBOLD C J，WALLACE R J，MCKAIN N.Effects of the ionophore tetronasin on nitrogen metabolism by ruminal microorganisms in vitro［J］.Journal of Animal Science，1990，68(4):1103－1109.

［23］HINO T，RUSSELL J B.Effect of reducing-equivalent disposal and NADH/NAD on deamination of amino acids by intact rumen microorganisms and their cell extracts［J］.Applied and Environmental Microbiology，1985，50(6):1368－1374.

［24］WALLACE R J，BRODERICK G A，BRAMMALL M L.Microbial protein and peptide metabolism in rumen fluid from faunated and ciliate-free sheep［J］.British Journal of Nutrition，1987，58(1):87－93.

［25］JOUANY J P.Effect of rumen protozoa on nitrogen utilization by ruminants［J］.The Journal of Nutrition，1996，126(Suppl.4):1335S －1346S.

［26］ZINN R A，PLASCENCIA A，BARAJAS R.Interaction of forage level and monensin in diets for feedlot cattle on growth performance and digestive function［J］.Journal of Animal Science，1994，72(9):2209－2215.