呂尊周 袁肖笑 蔡兆偉 尹兆正

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310029)

抗菌肽(AMPs)是一類小于100個氨基酸的小分子多肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，其具有廣譜的抗菌活性，是生物體先天免疫系統(tǒng)的組成成分?？咕木哂胁煌诳股氐淖饔锰攸c，不易產(chǎn)生耐藥性，是今后替代抗生素的理想飼料添加劑之一，在畜牧業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類已達上千種，但由于抗菌肽的來源問題以及作用機制不明確，可作為飼料添加劑的抗菌肽種類較少。已有研究表明，飼糧中添加抗菌肽對肉雞、肉鴨和斷奶仔豬均具有促生長的作用［1－3］。在免疫方面，飼喂動物腸道來源的抗菌肽可以提高雛雞的體液免疫反應(yīng)，增強腸道黏膜的免疫功能［4－6］。但目前關(guān)于抗菌肽在蛋雞產(chǎn)蛋階段的研究還鮮有報道。作者在前期的飼養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌抗菌肽能改善蛋雞的產(chǎn)蛋性能。因此，本試驗在前期試驗的基礎(chǔ)上，研究不同水平抗菌肽對蛋雞免疫功能的影響，通過對蛋雞脾臟系數(shù)、血清免疫指標以及脾臟白細胞介素2(IL-2)mRNA表達量的測定分析，初步探討抗菌肽對機體免疫調(diào)控的作用機制，為今后在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及試驗飼糧

試驗動物為30周齡海塞克斯褐殼蛋雞。試驗基礎(chǔ)飼糧在參照美國NRC(1994)蛋雞營養(yǎng)需要量的基礎(chǔ)上，結(jié)合海塞克斯蛋雞飼養(yǎng)手冊配制而成(表1)。試驗用抗菌肽由杭州保安康生物技術(shù)有限公司提供(枯草芽孢桿菌天然抗菌肽，有效含量1%)，由37個氨基酸組成，分子質(zhì)量為3～5 ku。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗設(shè)計

選擇480只30周齡、體重及產(chǎn)蛋率基本一致的海塞克斯褐殼商品蛋雞，隨機分成4個組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)30只雞。Ⅰ組為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧;Ⅱ～Ⅳ組為試驗組，分別在基礎(chǔ)飼糧中添加200、400、600 mg/kg抗菌肽。預(yù)試期7 d，正試期28 d。采用4層階梯式籠養(yǎng)，自由采食及飲水，光照16 h，免疫程序按常規(guī)進行。

1.3 屠宰及樣品采集

試驗結(jié)束最后1 d，每組隨機選取12只雞(每個重復(fù)3只)空腹稱重，頸動脈放血、自然析出血清，離心后分裝，－20℃保存待測。采集脾臟，迅速稱重后剪成小塊，液氮中速凍，－70℃保存。

1.4 脾臟系數(shù)測定

屠宰雞全部測定脾臟系數(shù)。

脾臟系數(shù)(g/kg)=脾臟重(g)/活重(kg)。

1.5 血清免疫指標測定

每組隨機取8個樣本測定血清免疫指標，血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體3(C3)和補體4(C4)含量采用免疫比濁法測定，試劑盒購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，分析儀器為Rx Daytona全自動生化分析儀。

1.6 脾臟IL-2 mRNA相對表達量檢測

1.6.1 總RNA的提取和cDNA的合成

每組隨機取8個樣本提取總RNA，RNA提取所用的試管、器皿、槍頭均用0.1%焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate，DEPC)水處理過夜后，高壓滅菌。提取步驟按照RNA prep pure動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說明進行。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

取1 μg總RNA按照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.6.2 引物的設(shè)計和合成

根據(jù)GenBank上公布的雞的IL-2基因mRNA序列，使用Primer 3.0設(shè)計1對引物，內(nèi)參基因β肌動蛋白(β-actin)引物序列參照Higgs等［7］設(shè)計。引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物詳細信息見表2。

1.6.3 標準曲線的建立和IL-2 mRNA熒光定量PCR檢測

隨機取一個 cDNA樣本，取2 μL，依次10倍梯度稀釋獲得 1 ×10－1、1 ×10－2、1 ×10－3、1 ×10－4濃度的稀釋產(chǎn)物。以稀釋的cDNA作為標準品模板，每個稀釋濃度設(shè)3個重復(fù)，采用SYBR GreenⅠ染料法在ABI StepOnePlusTM實時熒光定量PCR擴增儀上進行擴增。反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，加 dH2O 至 20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃變性 5 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析，判定引物的特異性。采用上述反應(yīng)體系和條件對各樣本進行實時熒光定量PCR擴增。

表2 引物序列及參數(shù)Table 2 Primer sequences and parameters

1.7 數(shù)據(jù)分析

目的基因相對表達量按以下公式計算:

式中:Ct為閾值循環(huán)。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中ANOVA進行分析，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，各組間平均值的比較采用LSD多重比較進行差異性顯著檢驗，以P＜0.05作為顯著性判斷標準。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽對蛋雞脾臟系數(shù)的影響

由表3可知，抗菌肽能不同程度地提高蛋雞的脾臟系數(shù)。與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組蛋雞脾臟系數(shù)分別提高了 11.54%(P ＞0.05)、27.99(P ＜0.05)、11.65%(P ＞0.05)。

表3 抗菌肽對蛋雞脾臟系數(shù)的影響Table 3 Effects of AMPs on spleen coefficient of laying hens

2.2 抗菌肽對蛋雞血清免疫指標的影響

由表4可見，與對照組相比，添加抗菌肽能不同程度地提高蛋雞的血清免疫水平?？咕慕MIgA 含量分別提高了 7.69%(P ＞0.05)、19.40%(P ＜0.05)和 14.38%(P ＞0.05)，IgG 含量分別提高了 12.69%(P ＞ 0.05)、21.24%(P ＜ 0.05)和 9.10%(P ＞0.05)，IgM 含量分別提高了3.12%(P ＞0.05)、7.23%(P ＞ 0.05)和 13.6%(P＞0.05)，C3含量分別提高了 12.12%(P ＞0.05)、11.85%(P ＞ 0.05)和 15.56%(P ＞0.05)，但抗菌肽的添加對C4含量并沒有顯著影響(P ＞0.05)。

表4 抗菌肽對蛋雞血清免疫指標的影響Table 4 Effects of AMPs on serum Immune indices of laying hens g/L

2.3 標準曲線和熔解曲線分析

用ABI StepOnePlusTM實時熒光定量PCR擴增儀建立目的基因和內(nèi)參基因的標準曲線，并檢驗引物的特異性。由圖1和圖2可知，IL-2和β-actin基因標準曲線的線性擬合較好，兩者擴增效率相差5%以內(nèi)。2－△△Ct法是一種在實時熒光定量PCR中分析基因表達相對變化的最簡便的方法，但使用的前提是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率基本相同，本試驗的擴增效率符合這一要求，可以使用該方法對結(jié)果進行分析。PCR反應(yīng)結(jié)束后進行熔解曲線分析表明，熔解曲線平穩(wěn)且峰形單一，說明無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物形成。

圖1 IL-2 cDNA片段實時熒光定量PCR標準曲線(A)和熔解曲線(B)Fig.1 Real-time quantitative PCR standard curves(A)and melt curves(B)of IL-2 cDNA fragment

圖2 β-actin cDNA片段實時熒光定量PCR標準曲線(C)和熔解曲線(D)Fig.2 Real-time quantitative PCR standard curves(C)and melt curves(D)of β-actin cDNA fragment

2.4 抗菌肽對蛋雞脾臟IL-2 mRNA表達量的影響

由圖3可見，與對照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組能顯著提高脾臟中IL-2 mRNA的表達量(P＜0.05)，而Ⅳ組雖有一定程度的提高(P＞0.05)，但表達量在抗菌肽組中為最低。

3 討論

脾臟是禽類重要的外周免疫器官，是免疫應(yīng)答以及抗體產(chǎn)生的主要器官。免疫器官重量是反映免疫器官功能狀態(tài)的一個重要指標。馬衛(wèi)明［8］研究表明，豬小腸抗菌肽能顯著提高雛雞脾臟、胸腺和法氏囊指數(shù)。楊玉榮等［9］報道，鴕鳥皮膚抗菌肽能顯著提高4～7日齡雛雞的免疫器官指數(shù)，對其他日齡雞免疫器官影響不顯著。但也有研究表明抗菌肽對肉鴨或肉雞的免疫器官并無顯著影響［10－11］。研究結(jié)果不同的原因可能是選用的抗菌肽種類以及動物品種不同所致。本研究表明，添加抗菌肽后蛋雞的脾臟指數(shù)有不同程度的提高，其中400 mg/kg組顯著提高。但添加高劑量的抗菌肽時，脾臟指數(shù)有下降的趨勢，表明脾臟對抗菌肽有一定的耐受范圍，過高劑量有可能抑制免疫器官的發(fā)育，至于抗菌肽如何影響免疫器官發(fā)育尚有待進一步的探討。

圖3 抗菌肽對蛋雞脾臟IL-2 mRNA表達量的影響Fig.3 Effects of AMPs on expression of IL-2 mRNA in spleen of laying hens

免疫球蛋白是機體對抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要產(chǎn)物，具有各種免疫功能。補體是存在于血清中不耐熱具有酶活性的球蛋白，激活后具有細胞溶解、細胞黏附、調(diào)理、免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、中和病毒等重要的生物學(xué)效應(yīng)?？咕氖求w內(nèi)防御體系重要的組成成分，研究表明，用人的α－防御素注射小鼠14 d后其血清中免疫球蛋白G1(IgG1)、免疫球蛋白G2a(IgG2a)、免疫球蛋白G2b(IgG2b)含量顯著升高［12］。Yang 等［4］報道，1日齡雛雞飼喂雞小腸抗菌肽后，血清IgG和IgM的含量分別在第4～10天和第10～17天顯著提高，其特異性免疫也得到加強。姚俊等［13］研究發(fā)現(xiàn)無特定病原體(SPF)雞肌肉注射豬腸道抗菌肽后能顯著增加各段腸道內(nèi)杯狀細胞的數(shù)量，同時各腸段分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分泌量也顯著增加，說明豬小腸抗菌肽能提高腸道黏膜的免疫功能。本研究與上述研究結(jié)果基本一致，所選用的枯草芽孢桿菌抗菌肽也具有類似的免疫增強效果，蛋雞血清中IgA、IgG、IgM和C3含量均有一定程度的提高，其中400 mg/kg抗菌肽能顯著提高IgA和IgG的含量，但補體C4的含量有一定的降低，但不顯著。作者在前期的飼養(yǎng)試驗中對蛋雞的生產(chǎn)性能進行分析，發(fā)現(xiàn)400 mg/kg組能顯著提高蛋雞的產(chǎn)蛋率，而另外2個試驗組與對照組差異并不顯著，同時抗菌肽有提高平均蛋重的趨勢，但差異并不顯著。這說明上述免疫指標的改變并未影響蛋雞的生產(chǎn)性能。

Tani等［12］報道，體外培養(yǎng)的小鼠脾細胞用人的的α－防御素刺激后能增殖并促進細胞因子干擾素γ(IFN-γ)和白細胞介素4(IL-4)的分泌。在對人類防御素研究中發(fā)現(xiàn)，人抗菌肽LL-37能通過受體依賴機制刺激先天性免疫細胞釋放細胞因子白細胞介素 1β(IL-1β)［14］，并能夠協(xié)同 IL-1β提高人外周血液單核細胞中細胞因子白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素10(IL-10)和趨化因子的產(chǎn)生［15］。但 Hancock 等［16］認為抗菌肽除了可以直接在溶菌酶協(xié)助下殺死微生物，還在細胞介素反應(yīng)中扮演反饋調(diào)節(jié)的作用，例如昆蟲抗菌肽CEMA能夠抑制RAW細胞中白細胞介素15(IL-15)的表達。目前，抗菌肽對蛋雞脾臟IL-2 mRNA表達量的影響還鮮有報道。IL-2對于機體的免疫應(yīng)答起著重要的作用，IL-2主要有輔助性 T細胞1(Th1)、細胞毒性T細胞(Tc)以及自然殺傷細胞(NK)產(chǎn)生，它能促進T細胞增殖分化和細胞因子的形成，增強Tc、NK和淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)活性，促進B細胞增殖和抗體生成。本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能促進雞脾臟IL-2 mRNA的表達量，其中200和400 mg/kg抗菌肽組能顯著提高其表達量，但600 mg/kg組與400 mg/kg組相比，脾臟IL-2 mRNA的表達量有降低的趨勢，這與本試驗中蛋雞脾臟系數(shù)以及血清免疫球蛋白的變化具有一致性，說明高劑量的抗菌肽有可能對動物產(chǎn)生免疫抑制作用，這有可能是抗菌肽在細胞介素的反應(yīng)中存在負反饋調(diào)節(jié)的作用導(dǎo)致對免疫的負向調(diào)節(jié)。作者推測，抗菌肽可能通過促進脾臟中IL-2的表達進而促進抗體的生成，從而提高了血清中抗體的含量，而高劑量的抗菌肽由于負反饋的調(diào)節(jié)使得抗體含量下降。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加抗菌肽能不同程度地提高蛋雞的脾臟系數(shù)，調(diào)節(jié)血清免疫水平，200和400 mg/kg抗菌肽添加水平能顯著促進脾臟IL-2 mRNA的表達量。綜合本試驗結(jié)果，飼糧中以添加400 mg/kg抗菌肽對蛋雞的免疫效果為最佳。

［1］溫劉發(fā)，張常明.抗菌肽代替抗生素在斷奶仔豬飼糧中的應(yīng)用效果［J］.中國飼料，2001(18):13－14.

［2］黃永彤，黃自然，黃建清，等.抗菌肽與抗生素飼喂肉雞的效果比較［J］.廣東飼料，2004，13(2):24－25.

［3］陳曉生，劉為民，周慶國，等.飼糧中添加抗菌肽對肉鴨血清代謝激素及生理生化指標的影響［J］.獸藥與飼料添加劑，2005，10(2):4 －6.

［4］YANG Y R，JIANG Y B，SHE R P，et al.Effects of chicken intestinal antimicrobial peptides on humoral immunity of chickens and antibody titres after vaccination with infectious bursal disease virus vaccine in chicken［J］.Archives of Animal Nutrition，2006，60(5):427－435.

［5］BAO H，SHE R，LIU T，et al.Effects of pig antibacterial peptides on growth performance and intestine mucosal immunity of broiler chickens［J］.Poultry Science，2009，88(2):291－297.

［6］WANG D，MA W，SHE R，et al.Effects of swine gut antimicrobial peptides on the intestinal mucosal immunity in specific-pathogen-freechickens［J］.Poultry Science，2009，88(5):967－974.

［7］HIGGS R，LYNN D J，GAINES S，et al.The synthetic form of a novel chicken beta-defensin identified in silico is predominantly active against intestinal pathogens［J］.Immunogenetics，2005，57:90 － 98.

［8］馬衛(wèi)明.豬小腸抗菌肽分離鑒定及其生物學(xué)活性研究［D］.博士學(xué)位論文.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004:78－79.

［9］楊玉榮，梁宏德，衛(wèi)紅麗.鴕鳥皮膚抗菌肽對雛雞免疫器官指數(shù)及T淋巴細胞數(shù)量的影響初探［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25(20):46 －48.

［10］陳曉生，溫劉發(fā)，張輝華，等.飼糧中添加抗菌肽對肉鴨生產(chǎn)性能及免疫器官、內(nèi)臟器官的影響［J］.畜禽業(yè)，2005(2):12－13.

［11］厲寶林，趙東偉，蒲俊華，等.日糧中添加不同生物制劑對雞免疫機能的影響［J］.中國家禽，2007，29(9):22－24.

［12］TANI K，MURPHY W J，CHERTOV O，et al.Defensins act as potent adjuvants that promote cellular and humoral immune responses in mice to a lymphoma idiotype and carrier antigens［J］.International Immunology，2000，12(5):691－700.

［13］姚俊，王德成，佘銳萍，等.豬小腸抗菌肽對SPF雞腸道黏膜免疫功能的影響［J］.科學(xué)技術(shù)與工程，2009(17):4918－4923.

［14］ELSSNER A，DUNCAN M，GAVRILIN M，et al.A novel P2X7receptor activator，the human cathelicidin-derived peptide LL37，induces IL-1β processing and release［J］.The Journal of Immunology，2004，172(8):4987－4994.

［15］YU J，MOOKHERJEE N，WEE K，et al.Host defense peptide LL-37，in synergy with inflammatory mediator IL-1β，augments immune responses by multiple pathways［J］.The Journal of Immunology，2007，179(11):7684－7691.

［16］HANCOCK R E W，SCOTT M G.The role of antimicrobial peptides in animal defenses［J］.PNAS，2000，97(16):8856－8861.