吳超，任丹丹，陳倩，汪秋寬

(大連海洋大學遼寧省水產品加工及綜合利用重點開放實驗室，遼寧大連116023)

巖藻黃素 (Fucoxanthin，簡稱FUC)是一種主要存在于褐藻中的類胡蘿卜素。目前，國內學者僅對巖藻黃素做了初步的提取分離及含量測定的工作［1－3］，而對于巖藻黃素活性的系統(tǒng)研究很少有人涉及。深入系統(tǒng)地研究巖藻黃素的活性，不僅對其在藥品和保健品上應用具有重要意義，而且能促進海帶精深加工產業(yè)的發(fā)展。本試驗中，作者對海帶巖藻黃素的體外抗氧化作用進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用海帶Laminaria japonica購于大連市黑石礁市場;試驗動物為昆明種小白鼠，雌雄各半，體質量為 (28±2)g，購于大連醫(yī)科大學實驗動物中心 (合格批號SCXK(遼)2008－0002)。巖藻黃素標準品購于Sigma公司;2－硫代巴比妥酸、三羥甲基氨基甲烷 (Tris)由國藥集團化學試劑有限公司生產;硅藻土為化學純，由天津市大茂化學試劑廠生產;其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 海帶巖藻黃素的提取 取適量新鮮海帶，用組織搗碎機絞碎后，采用混合有機溶劑石油醚－丙酮 (1∶1)浸提3次，將提取液倒入分液漏斗，棄下層丙酮層。向石油醚層中加入適量無水硫酸鈉，干燥、過濾，對濾液進行減壓濃縮 (＜40℃)，即得海帶色素粗提物。經氧化鎂－硅藻土(1∶2)柱層析分離純化，制得巖藻黃素 (FUC)。通過硅膠G薄層層析，與巖藻黃素標準品對照進行鑒定，并鑒定其純度可達到90%以上。將其濃縮至干后，用無水乙醇溶解備用。按文獻 ［4］中的方法測定巖藻黃素的含量，巖藻黃素含量 (mg)=A446nm×總體積 (mL)×稀釋倍數(shù)×10÷1660。

1.2.2 FUC對紅細胞溶血的影響［5］取小鼠動脈血，加肝素抗凝后，以2000 r/min離心，棄上層。用預冷的生理鹽水洗滌數(shù)次，離心，至上層液無紅色，即得紅細胞。用生理鹽水進行稀釋，制得0.5%紅細胞懸浮液。在各管中加入0.2 mL不同濃度的 FUC(5、10、20、30、40 μg/mL)，再加入紅細胞懸液 1.5 mL、0.05 mL的 H2O2(60 mmol/L)，以H2O2+紅細胞為對照組，同時設背景空白管?；靹?，37℃下溫育1 h，取出后用流水冷卻，以2000 r/min離心5 min，取上清液按一定倍數(shù)稀釋，在415 nm波長下測定吸光度，樣品管的吸光度記為A1i，背景空白管的吸光度記為A2i，對照管的吸光度記為A0。抑制率按下式計算:

1.2.3 FUC對肝勻漿液脂質過氧化的影響

1)FUC對肝勻漿液自發(fā)性脂質過氧化的影響［5－6］。取小鼠肝臟組織，用預冷的生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干表面水分，在冰浴中勻漿，制成質量分數(shù)為4%的肝勻漿液。取肝勻漿液0.3 mL，再加入不同濃度的 FUC(5、10、15、20、30 μg/mL)0.2 mL，對照組加入0.2 mL的無水乙醇，混勻。37℃下溫育1 h后，用流水冷卻。各管加入質量分數(shù)為15%的三氯乙酸1 mL和質量分數(shù)為0.67%的硫代巴比妥酸1 mL，混勻后沸水浴15 min，取出后用流水冷卻。以3000 r/min離心10 min，取上清液在532 nm波長下測定吸光度，按式(1)計算抑制率。

2)FUC對用H2O2－Fe2+誘導的肝勻漿液脂質過氧化的影響［7］。取小鼠肝臟組織，制成質量分數(shù)為1%的肝勻漿液。取此肝勻漿液0.2 mL，加入不 同 濃 度 (5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0μg/mL)的FUC 0.2 mL，同時設背景空白管和對照管，再加入6 mmol/L的FeSO40.05 mL和60 mmol/L的H2O20.05 mL，混勻，在37℃下溫育1 h，用流水冷卻。然后進行同上的操作，測定A532nm，并根據(jù)式 (1)計算抑制率。

1.2.4 FUC對肝線粒體脂質過氧化的影響［8］

1)FUC對肝線粒體自發(fā)性脂質過氧化的影響。取小鼠肝臟，加入適量0.25 mol/L蔗糖溶液，在冰浴中制成質量分數(shù)為10%的肝勻漿液。4℃下以3000 r/min離心20 min，棄上清液，用預冷的0.25 mol/L蔗糖溶液將沉淀洗兩次，合并棄上清液。在4℃下以10000 r/min離心20 min，用預冷的0.25 mol/L蔗糖溶液將沉淀洗兩次，合并沉淀，即為線粒體。用0.02 mol/L的Tris－HCl緩沖溶液(pH 7.4)將線粒體按一定倍數(shù)稀釋，使其吸光度為0.6～0.8，即制得肝線粒體溶液。取線粒體溶液1 mL，依次加入0.2 mL不同濃度的FUC(2.5、4.0、10.0、15.0、20.0、40.0 μg/mL)，混 勻，在37℃下溫育1 h，取出后用流水冷卻，然后測定A532nm，并根據(jù)式 (1)計算抑制率。

2)FUC對VC－Fe2+誘導的肝線粒體脂質過氧化的影響。取肝線粒體溶液1 mL，依次加入0.2 mL不同濃度的 FUC(2.5、4.0、10.0、15.0、20.0、40.0 μg/mL)、0.2 mol/L 的 Tris－HCl緩沖溶液 (pH 7.4)0.1 mL、3.5 mol/L的 KCl溶液0.05 mL、5 mmol/L的 FeSO40.2 mL，以及 10 mmol/L的VC 0.1 mL，37℃下溫育1 h后取出，測定A532nm值，并根據(jù)式 (1)計算抑制率。

1.2.5 FUC對VC－Fe2+系統(tǒng)誘導肝線粒體腫脹度的影響［5，9］取肝線粒體1.2 mL，依次加入0.2 mL 不同濃度的 FUC(1、5、10 μg/mL)，42.5 μmol/L的FeSO40.2 mL，以及0.85 mmol/L的VC 0.1 mL，測定A520nm值，每隔20 min測定一次，觀察吸光值的變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次試驗設3個平行，取其平均值為一次試驗數(shù)據(jù)，試驗重復3次。試驗數(shù)據(jù)采用SAS軟件處理，以μs表示。

2 結果與討論

2.1 FUC對紅細胞溶血的影響

在自由基過量存在的條件下，紅細胞膜易發(fā)生脂質過氧化，結果導致紅細胞膜脆性增加，膜破損嚴重，出現(xiàn)溶血。H2O2可使紅細胞膜產生氧化損傷而出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。從表1可見，巖藻黃素可以降低因H2O2所導致的紅細胞溶血的影響，其中樣品組與對照組相比，紅細胞溶血量 (A415nm值)極顯著降低 (P＜0.01)，說明海帶巖藻黃素具有清除自由基的能力，從而保護紅細胞膜，減少紅細胞膜氧化損傷，抑制紅細胞溶血的發(fā)生，并呈良好的劑量效應關系。

表1 巖藻黃素對紅細胞溶血的影響Tab.1 Effects of fucoxanthin on red blood cell hemolysis

2.2 FUC對肝勻漿液脂質過氧化的影響

2.2.1 FUC對肝勻漿液自發(fā)性脂質過氧化的影響肝勻漿液自身在溫育條件下，可發(fā)生自氧化反應，產生氧自由基。這些自由基能通過攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質過氧化反應［5］。從表2可見，樣品組與對照組相比，丙二醛生成量(A532nm值)極顯著降低 (P＜0.01)，說明海帶巖藻黃素具有抑制由氧自由基引起的小鼠肝細胞脂質過氧化作用，且抑制率隨巖藻黃素濃度的增加而增大。

表2 巖藻黃素對肝勻漿液自發(fā)性脂質過氧化的影響Tab.2 Effects of fucoxanthin on lipid auto－peroxidation in liver homogenate

2.2.2 FUC對用H2O2－Fe2+誘導的肝勻漿液脂質過氧化的影響 H2O2與Fe2+結合產生的羥基自由基 (·OH)可引發(fā)脂質過氧化作用。從表3可見，樣品組與對照組相比，丙二醛生成量 (A532nm值)極顯著降低 (P＜0.01)，說明海帶巖藻黃素具有清除羥基自由基的能力，從而抑制小鼠肝組織的脂質過氧化，且抑制率隨巖藻黃素濃度的增加而增大。

表3 巖藻黃素對H2O2－Fe2+誘導的肝勻漿液脂質過氧化的影響Tab.3 Effects of fucoxanthin on lipid peroxidation induced by H2O2－Fe2+in liver homogenate

2.3 FUC對肝線粒體脂質過氧化的影響

2.3.1 FUC對肝線粒體自發(fā)性脂質過氧化的影響從表4可見，樣品組與對照組相比，丙二醛生成量 (A532nm值)極顯著降低 (P＜0.01)，說明海帶巖藻黃素能夠抑制氧自由基引起的小鼠肝線粒體脂質過氧化，且抑制率隨海帶巖藻黃素濃度的增加而增大。

表4 巖藻黃素對肝線粒體自發(fā)性脂質過氧化的影響Tab.4 Effects of fucoxanthin on lipid auto－peroxidation in liver mitochondria

2.3.2 FUC對VC－Fe2+誘導的肝線粒體脂質過氧化的影響 在VC－Fe2+誘導條件下 (表5)，樣品組與對照組相比，隨著巖藻黃素濃度的增加，丙二醛生成量 (A532nm值)逐漸降低 (P＜0.01)，說明巖藻黃素具有清除羥基自由基的能力，從而抑制小鼠肝線粒體的脂質過氧化，且具有劑量效應關系。

表5 巖藻黃素對VC－Fe2+誘導的肝線粒體脂質過氧化的影響Tab.5 Effects of fucoxanthin on lipid peroxidation induced by VC－Fe2+in liver mitochondria

2.4 巖藻黃素對VC－Fe2+誘導肝線粒體腫脹程度的影響

從圖1可看見，隨著時間的延長，各組吸光值均有所下降，但正常組變化非常小，而樣品組和對照組變化幅度較大，說明線粒體膜在·OH存在的條件下受到損傷，發(fā)生腫脹。其中對照組下降幅度最明顯，而樣品組的下降趨勢明顯減緩，且高劑量組損傷程度低于低濃度組，具有一定的劑量效應關系，表明巖藻黃素可抑制·OH所導致的線粒體氧化的損傷程度，減輕其腫脹程度。

圖1 巖藻黃素對VC－Fe2+誘導肝線粒體腫脹程度的影響Fig.1 Effects of fucoxanthin on liver mitochondria swelling induced by VC－Fe2+

3 結語

本研究結果表明，海帶巖藻黃素對紅細胞溶血、肝勻漿液及肝線粒體脂質過氧化、肝線粒體的腫脹程度等均具有很好的抑制效果，且具有明顯的劑量效應關系。表明海帶巖藻黃素可清除生物體內多余的氧自由基，保護生物體內的生物膜 (如紅細胞膜和線粒體膜)，防止生物膜的氧化損傷，具有很強的抗氧化能力。由于目前國內對巖藻黃素的研究較少，巖藻黃素的抗氧化機理還有待進一步深入研究。

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