梁新紅,孫俊良,唐玉,郭祖峰
(河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)
糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC 3.2.1.3),是一種外切型糖苷酶,從淀粉的非還原性末端依次水解α-1,4糖苷鍵,水解下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元,工業(yè)上用于將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖,因而廣泛地用于制藥、制酒及氨基酸、有機(jī)酸行業(yè),是最重要的工業(yè)酶制劑之一[1-2].黑曲霉(Aspergillus niger)是生產(chǎn)葡萄糖淀粉酶重要菌株之一[3-4].發(fā)酵液中糖化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究對(duì)糖化酶在工業(yè)中應(yīng)用至關(guān)重要[5].本研究擬對(duì)已篩選到的A.niger FJL 0801進(jìn)行分離純化,并研究其酶學(xué)性質(zhì),以豐富糖化酶研究內(nèi)容,為可能的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)新的糖化酶資源.
菌種:黑曲霉(Aspergillus niger FJL0801),河南科技學(xué)院食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室冷藏保存.
DEAE-Fast Flow陰離子交換柱(16 mm×100 mm),Superdex-75層析柱(26 mm×600 mm),美國惠普公司.
1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶條件 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基:淀粉 10 g;NaNO32 g;K2HPO41 g;KCl 0.5 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;FeSO4·7H2O0.01 g;蒸餾水 1 000 mL,自然 pH.
發(fā)酵搖瓶培養(yǎng):把發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中,裝液量為80 mL.按5%接種量把半干體培養(yǎng)基接種于發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,于33℃下恒溫?fù)u床培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為210 r/min.
1.2.2 糖化酶的分離純化 發(fā)酵液6 000 r/min離心15 min去菌體,所得上清液為粗酶液,總量為200 mL.粗酶液進(jìn)行80%飽和的硫酸銨鹽析沉淀,8 000 r/min離心30 min,沉淀經(jīng)去離子水透析,進(jìn)行冷凍干燥.凍干后,用3mL檸檬酸-磷酸氫二鈉(pH4.5)緩沖液溶解后,上DEAE-52陰離子交換柱(16mm×100mm),采用10 mmol的Tris-HCl緩沖液(含2 mmol CaCl2,pH8.4)進(jìn)行平衡,上樣后使用含有0~1 mol NaCl的同樣緩沖液進(jìn)行梯度洗脫,洗脫速度為2 mL/min,收集合并酶活峰后,上預(yù)先經(jīng)10 mmol的Tris-HCl(pH6.5)緩沖液平衡好的Superdex-50層析柱(26 mm×600 mm)進(jìn)行洗脫,洗脫速度2 mL/min,收集合并酶活峰,經(jīng)去離子水透析,凍干,用于酶學(xué)性質(zhì)研究.
1.2.3 糖化酶活力測定方法 粗酶液活力按照GB/T1805.2-93測定[6].
1.2.4 蛋白含量測定 按Bradford方法測定[7],以牛血清白蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.
1.3.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活,以酶活最高者為100%.熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中測殘余酶相對(duì)活力,以未保溫的酶液的酶活為100%.
1.3.2 酶的最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性 將酶液分別用pH3.0~6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH6.0~8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋,按標(biāo)準(zhǔn)方法測酶活力.
1.4 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)平行重復(fù)4次.采用DPSv7.55數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差顯著性進(jìn)行分析.
黑曲霉糖化酶粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-52陰離子交換柱和SephadexG-50凝膠層析后,酶蛋白得到明顯純化.糖化酶的純化結(jié)果如表1.
表1 糖化酶純化結(jié)果
圖1 溫度對(duì)A.niger FJL 0801糖化酶活性的影響
由表1可知,純化后酶的比活力達(dá)到了58.40 U/mg,較粗酶液純化了38.42倍.但在純化過程中,酶活回收率達(dá)到17.45%,酶蛋白的損失主要在DEAE-52陰離子交換柱及SephadexG-50凝膠層析.
把經(jīng)分離純化的糖化酶在不同溫度下測定酶的活力,以探索糖化酶最適作用溫度,結(jié)果如圖1.
由圖1可知,A.niger FJL 0801糖化酶在30~60℃的溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高,相對(duì)酶活力(相對(duì)酶活規(guī)定方法:在一定溫度下所測最高酶活,其相對(duì)酶活為100%)逐漸升高,在溫度為60℃時(shí),相對(duì)酶活達(dá)最高100%.反應(yīng)溫度高于60℃后,相對(duì)酶活急劇下降,溫度為70℃時(shí),相對(duì)酶活只有16.57%±0.94%,當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí),酶活為零.因此,糖化酶最適作用溫度為60℃.
把經(jīng)分離純化的糖化酶分別在30~60℃下保溫2 h,然后測定其殘留酶活,即為糖化酶在此溫度下穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2.
圖3 pH值對(duì)A.niger FJL 0801糖化酶活性的影響
圖2 A.niger FJL 0801糖化酶的溫度穩(wěn)定性
由圖2可知,糖化酶經(jīng)2 h保溫后,在30~60℃溫度范圍內(nèi)其酶活均有損失,溫度越高,酶活損失越多.在30℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活(在不同溫度下未保溫前測定酶活力的相對(duì)酶活力為100%.然后在同樣溫度下保溫2 h,再次進(jìn)行酶活力的測定,測定殘留酶活與未保溫酶活之比為保溫后的相對(duì)酶活)為92%±3.2%;在最適作用溫度60℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活只有42%±2.8%.因此,在糖化酶應(yīng)用時(shí),應(yīng)同時(shí)考慮酶的最適作用溫度及應(yīng)用溫度的穩(wěn)定性,以達(dá)到最優(yōu)糖化效果.
考察在pH值范圍為3.5~7.5的經(jīng)分離純化的A.niger FJL 0801糖化酶的最適反應(yīng)pH值.結(jié)果如圖3.由圖3可知,該酶的的最適反應(yīng)pH值為4.5,在pH4.5~5.5有較高的活力,其相對(duì)酶活(規(guī)定0 h測定酶活值的相對(duì)酶活為100%,其它時(shí)間相對(duì)酶活為測定酶活值與0 h酶活值之比)為100%±4.13%~76.23%±3.25%.在pH為3.5和6.5時(shí),酶活極低,相對(duì)酶活分別只有5.1%±0.26%和6.59%±0.36%,在pH為7.0時(shí),檢測不到酶活,酶活為0.因此,糖化酶最適作用pH值為4.5,酶應(yīng)用中,溶液pH值應(yīng)高于4.0及低于6.0.
在pH值為4.5時(shí)60℃保存一定時(shí)間,考察最適作用pH值穩(wěn)定性.保存時(shí)間設(shè)定為0~2 h,結(jié)果如圖4.
由圖4可知,糖化酶在最適作用pH值下,60℃作用糊精溶液0~120 min,其相對(duì)酶活從100%±3.19%降至42%±2.8%,表明在最適作用溫度及pH值下,其酶活力逐漸下降.作用時(shí)間在60 min以內(nèi),其酶活保存89%±2.56%;繼續(xù)增加作用時(shí)間,其酶活保存率較低,從89%±2.56%降至42%±2.8%.因此,在糖化酶應(yīng)用中,在酶的最適溫度和pH值下,應(yīng)掌握好酶的作用時(shí)間.
圖4 A.niger FJL 0801糖化酶的pH值穩(wěn)定性
黑曲霉糖化酶粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、DEAE-52陰離子交換柱和SephadexG-50凝膠層析后,酶的比活力達(dá)到了58.40 U/mg,較粗酶液純化了38.42倍,酶活回收率達(dá)到17.45%.
經(jīng)分離純化的糖化酶其最適作用溫度為60℃;糖化酶在30℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活為92±3.2%;在最適作用溫度60℃下,保溫2 h后,相對(duì)酶活只有42%±2.8%.
酶的的最適反應(yīng)pH值為4.5,在pH4.5下,60℃作用糊精溶液作用時(shí)間在60 min以內(nèi),其酶活保存89%±2.56%;繼續(xù)增加作用時(shí)間,其酶活保存率較低,從89%±2.56%降至42%±2.8%.
通過糖化酶的最適作用溫度、pH及其穩(wěn)定性研究,其酶學(xué)性質(zhì)基本符合淀粉糖化工業(yè)化過程中對(duì)酶的要求,該酶比較適合應(yīng)用于淀粉糖化工業(yè).
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