劉素杰 趙大偉 張 卓

（吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130012）

CIK是將人外周血單個核細胞在體外多種細胞因子（如抗CD3McAb、IL-1a、IL-2、IFN-γ）刺激后獲得的一群異質(zhì)細胞[1]。乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢，乳腺癌的生物治療是繼手術(shù)、放化療之外的又一項治療手段。本實驗通過對比研究健康人與乳腺癌患者兩種不同來源的CIK增殖能力及活性，進一步探討CIK細胞的抗腫瘤作用，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康人外周血樣本10例，年齡27～56歲，樣本來自吉林省腫瘤醫(yī)院體檢中心。乳腺癌患者外周血樣本10例，年齡39～58歲，樣本來自吉林省腫瘤醫(yī)院乳腺二科，全部病例均經(jīng)病理證實。

1.2 主要試劑

CD3單克隆抗體（北京邦定公司）；IL-1a、IL-2、IFN-γ（Strthmann Biotech GmbH，Germany），MTT（美國Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 CIK細胞制備及擴增

兩種不同來源地外周末梢血血樣，利用Isopaque離心法密度梯度分離外周血單個核細胞（PBMC），加入RPMI1640培養(yǎng)液，10%胎牛血清培養(yǎng)，加入100μg/mL，重組IFN-γ孵育24h后，再加入50μg/mLCD3McAb，100u/mL人重組IL-1a，300u/mLIL-2放置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，細胞每隔2d傳代培養(yǎng)。

1.3.2 CIK細胞的增殖測定

動態(tài)觀察細胞增殖，用血細胞計數(shù)板法計數(shù)細胞。

1.3.3 MTT法檢測CIK細胞對腫瘤細胞株殺傷活性

培養(yǎng)14d的CIK細胞為效應(yīng)細胞，分別與乳腺癌細胞株（MCF-7）、肝癌細胞株（SMMC-7721）、肺癌細胞株（SPC-A-1）3種靶細胞混合，按50∶1效靶比加入96孔板，每組3復(fù)孔。另設(shè)單獨靶細胞和效應(yīng)細胞組，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h，離心棄上清，每孔加二甲基亞砜150μL，振蕩溶解10min后，用酶標(biāo)儀570nm測OD值，計算CIK的殺瘤活性。殺傷活性（%）=[1-（實驗組OD值-效應(yīng)細胞OD值）/靶細胞OD值]×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，健康人與乳腺癌患者CIK細胞對3種腫瘤細胞株的抑瘤比較，采用成組比較t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CIK細胞在培養(yǎng)第3天開始出現(xiàn)增殖，至第21天增殖100余倍；乳腺癌患者來源的CIK細胞的增殖速度慢于健康人CIK細胞（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 健康人與乳腺癌患者CIK細胞體外增殖力對比[（±s），n=10]

表1 健康人與乳腺癌患者CIK細胞體外增殖力對比[（±s），n=10]

注：*與健康人相比P＜0.05

組別 CIK細胞增殖能力1d 7d 14d 21d健康人 1.05±0.04 31.25±2.74 89.90±4.83 176.82±14.62乳腺癌患者 1.03±0.07 19.33±1.42* 55.09±7.85* 107.68±15.36*

2.2 健康人與乳腺癌患者CIK細胞對3種腫瘤細胞株的抑瘤比較

乳腺癌患者CIK細胞對3種腫瘤細胞殺傷活性明顯低于健康人CIK細胞（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 健康人與乳腺癌患者CIK細胞對腫瘤細胞殺傷活性（%）

3 討 論

隨著分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和免疫學(xué)等研究的進展，乳腺癌的治療已經(jīng)由傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療治療模式向包括內(nèi)分泌治療、生物免疫治療和基因治療在內(nèi)的綜合治療模式轉(zhuǎn)變[2]。CIK細胞生物治療的手段之一。CIK細胞是由血液或骨髓單個核細胞在體外與多種細胞因子共同培養(yǎng)獲得，由于多種細胞因子之間的協(xié)同作用，使其具備殺傷活性對多種腫瘤細胞均有抑制生長作用[3-5]。本研究將健康人和乳腺癌患者的PBMC在同等條件下誘導(dǎo)CIK細胞。研究發(fā)現(xiàn)，健康人來源的CIK細胞其增殖率及殺傷活性均高于乳腺癌患者來源的CIK細胞。健康人來源CIK細胞對3種腫瘤細胞株均有不同程度殺傷。這種差異可能是腫瘤微環(huán)境對腫瘤患者免疫效應(yīng)細胞功能影響所致，腫瘤微環(huán)境常呈現(xiàn)酸性，可強烈抑制免疫效應(yīng)細胞的增生作用，細胞毒作用和代謝活性[6,7]。在臨床應(yīng)用中可以根據(jù)CIK細胞來源的不同及患者具體情況，選擇不同來源地CIK細胞進行治療。

[1] Schmidt Wolf IG,Lefterova P,Metha BA,et al.Phenotypic char acterization and identification of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cells[J].ExpHematol,1993,21(13):1673-1679.

[2] 代震波,毛偉征,牛兆建,等.體外擴增CIK細胞殺傷胃癌細胞SGC-7901[J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(2):100-103.

[3] 張輝,趙群,左連富,等.CIK細胞聯(lián)合順鉑對卵巢癌耐藥細胞SKOV3/CDDP的殺傷作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2007,14(4):381-384.

[4] Nagaraj S,Ziske C,Schmidt Wolf IG.Human cytokine-induced killer cells have enhanced in vitro cytotytic activity via nonviral interloukin-2 gene transfer[J].Genet Vaccines Ther,2004,2(1):12.

[5] 李敏,金真,李功杰,等.乳腺動態(tài)增強MRI參數(shù)與腫瘤血管的相關(guān)性及其鑒別診斷價值[J].磁共振成像,2010,1(1): 36-42.

[6] 任宏,胡恒通,劉剛,等.細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞對膽囊癌細胞株GBC-SD殺傷活性的影響[J].肝膽胰外科雜志,2006,18(5):282-285.

[7] 鄒征云,劉寶瑞,錢曉萍,等.從50ml外周血中高效擴增cik方法的探討[J].腫瘤防治雜志,2005,12(7):515-518.