侯金才，張 鵬，劉建勛，韓 笑，李 丹，王秀輝

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，北京 100091)

缺血缺氧是腦缺血重要的病理進(jìn)程，預(yù)防和治療腦缺血時(shí)的炎癥反應(yīng)是治療腦缺血的關(guān)鍵。TLR4已被證明在腦缺血時(shí)引起局部組織炎性反應(yīng)的重要受體，它介導(dǎo)細(xì)胞的天然免疫過程［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織只中的免疫細(xì)胞，它的活化使局部組織產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧，模擬腦缺血時(shí)腦組織內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境，借以激活TLR4通路，然后用清熱解毒中藥梔子的有效提取物梔子苷(geniposide)進(jìn)行干預(yù)，從TLR4信號(hào)通路探討梔子苷治療腦缺血的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物和主要試劑新生SD大鼠(出生24 h內(nèi))，級(jí)別 SPF/VAF，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(京)2006-0009，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

DMEM/F12培養(yǎng)基:Gibco公司;胰蛋白酶:Sig-ma公司;CD11b抗體:Chemicon公司，羊抗小鼠IGFITC與羊抗兔IG-TexRed均購于北京博奧森生物公司。TLR4、MyD88、pI-κB、NF-κBp65、p38 和 p-ERK1/2抗體均購于Abcam公司。梔子苷(純度95.2%，批號(hào)110715-200212，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

1.2大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)無菌條件下取出新生大鼠雙側(cè)大腦半球，置于預(yù)冷的解剖液中，迅速剝除腦膜，剔除髓質(zhì)的大部分，置于添加了5%胎牛血清的DMEM/F12中，剪碎成1 mm3的組織塊，1 000×g離心10 min，棄去上清，用0.25%胰酶+1 mmol·L－1EDTA的消化液于37℃中消化組織塊25 min，期間反復(fù)振搖兩次，以血清中止消化，之后反復(fù)吹打使之成為單細(xì)胞懸液，1 000×g離心10 min，棄去上清，D-hank's洗兩次，過200目的尼龍濾網(wǎng)，收集懸液1 000×g離心10 min，棄去上清，用添加了10%胎牛血清和青霉素1×105U·L－1、鏈霉素1×105U·L－1的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至4 個(gè)75 cm2培養(yǎng)瓶中，15 ml/瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3 d后換液去除死亡的細(xì)胞碎片，10 d左右混合膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)，旋緊瓶蓋，石蠟?zāi)し饪冢?7℃的恒溫?fù)u床中以200 r·min－1的速度振搖約12 h，收集細(xì)胞懸液，置于新培養(yǎng)瓶(板)中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕振搖培養(yǎng)瓶5 min，棄上清，所剩為小膠質(zhì)細(xì)胞，換上新鮮含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。

1.3小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定將小膠質(zhì)細(xì)胞接種到覆蓋玻片的培養(yǎng)孔內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，取出細(xì)胞，PBS沖洗，4%聚甲醛固定，一抗用CD11b(1∶100)，二抗為羊抗兔IG-FITC(1∶100)，0.01%的DAPI復(fù)染細(xì)胞核，1∶9甘油緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察。

1.4缺氧/復(fù)氧模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109·L－1，接種到24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 ml，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合狀態(tài)后，用PBS清洗兩次，更換培養(yǎng)液無糖DMEM培養(yǎng)液。缺氧在厭氧培養(yǎng)盒進(jìn)行，將培養(yǎng)板放入缺氧盒內(nèi)，向盒內(nèi)通入含95%N2和5%CO2的混合氣體，20 min(流量 1.5 L·min－1)，夾閉盒的出口與入口，37℃培養(yǎng)4 h，換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h即為缺氧/復(fù)氧模型。實(shí)驗(yàn)分組:①對(duì)照組:用正常培養(yǎng)液培養(yǎng);② 模型組:缺氧4 h，復(fù)氧12 h;③梔子苷低劑量組、中劑量組、高劑量組分別在缺氧時(shí)加入用無糖DMEM配制的終濃度分別為 125 μmol·L－1(低劑量組)、250 μmol·L－1(中劑量組)和 500 μmol·L－1(高劑量組)梔子苷，在復(fù)氧時(shí)加入由正常培養(yǎng)液配制的相應(yīng)濃度的藥物。梔子苷藥物濃度的選定是根據(jù)前期MTT的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在 125 μmol·L－1梔子苷對(duì)正常和缺氧/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞的活性沒有影響，250 和 500 μmol·L－1梔子苷能夠不同程度地促進(jìn)正常和缺氧/復(fù)氧小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。

1.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280為1.8～2.0，證實(shí)RNA純度符合RT-PCR反應(yīng)要求。以總RNA為模板，用Oligo-d(T)18為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，特異性引物分別擴(kuò)增TLR4和β-actin。TLR4引物序列為上游5'-GCACTGTTCTTCTCCTGCC-3'，下游5'-GTTTCCTGTCAGTATCAAG-3'(250 bp)。β-actin引物序列:上游 5'-TGTGCTATGTTGCCCTAGACT-3'，下游 5'-TCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3'(442 bp)。PCR條件為94℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃ 延伸 30 s，TLR4 循環(huán) 35 次，β-actin循環(huán)30次，最后72℃延伸7 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Qautity One軟件分析TLR4與β-actin的PCR產(chǎn)物灰度值，以二者比值來表示TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6Western blot檢測(cè)TLR4、p-IκBα、p38、p-ERK1/2蛋白將缺氧/復(fù)氧和LPS刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞以冰冷的PBS終止，洗兩次，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg樣品煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%的濃縮膠和10%的分離膠)，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，加抗體TLR4、p-IκB、p38、p-ERK1/2，陽性對(duì)照用 β-actin 單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗稀釋液(1∶3 000)37℃孵育1 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7MyD88和NF-κB免疫熒光雙染將小膠質(zhì)細(xì)胞接種到覆蓋玻片的培養(yǎng)孔內(nèi)，貼壁生長(zhǎng)48 h后，進(jìn)行缺氧/復(fù)氧和梔子苷干預(yù)后，取出細(xì)胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，一抗分別為MyD88(小鼠抗大鼠)和 NF-κBp65(兔抗大鼠)，抗體濃度為1∶200;二抗為羊抗小鼠 IG-TexRed和羊抗兔 IGFITC(1∶200)，0.01%的DAPI復(fù)染細(xì)胞核，1∶9甘油緩沖液封閉，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定培養(yǎng)3 d時(shí)首次換液倒置顯微鏡下觀察分離出的細(xì)胞呈團(tuán)狀聚集，均勻鋪于瓶底;6 d后可見大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)中爬出伸展，鋪于星形膠質(zhì)細(xì)胞之上的胞體較小而發(fā)亮、折光性強(qiáng)、突起短小彎曲而密集、形如蜘蛛腿的則是小膠質(zhì)細(xì)胞，另外有少數(shù)圓形或者橢圓形的小膠質(zhì)細(xì)胞呈一定程度活化狀態(tài);10 d后小膠質(zhì)細(xì)胞基本匯合，此時(shí)可以振搖純化小膠質(zhì)細(xì)胞。純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞牢牢地貼附于瓶底生長(zhǎng)，大部分小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，折光性強(qiáng)而發(fā)亮，突起短小彎曲，形似蜘蛛腿，少數(shù)可見細(xì)長(zhǎng)突起;還有一部分小膠質(zhì)細(xì)胞呈圓形、扁圓形、或棒狀，這樣的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示出一定程度的活化狀態(tài)。

Tab 1 Effect of geniposide on the hypoxia/reoxygenation induced microglia(±s，n=3)

Tab 1 Effect of geniposide on the hypoxia/reoxygenation induced microglia(±s，n=3)

*P＜0.01 vs model

Group Control Model Geniposide/μmol·L －1 125 μmol·L －1 250 μmol·L －1 500 μmol·L －1 TLR4 0.3019 ±0.012* 0.4527 ±0.028 0.4319 ±0.022 0.4401 ±0.035 0.2857 ±0.016*p-ERK1/2 0.2964 ±0.035* 0.5361 ±0.051 0.5085 ±0.043 0.2894 ±0.015* 0.3018 ±0.016*p-IκB 0.3545 ±0.041* 0.4908 ±0.042 0.3853 ±0.031 0.3038 ±0.037* 0.3116 ±0.024*p38 0.2737 ±0.016* 0.4426 ±0.039 0.4318 ±0.033 0.3179 ±0.028* 0.2824 ±0.019*

小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定用CD11b抗體，細(xì)胞膜上有明顯的綠色熒光染色，胞核空泡樣，符合細(xì)胞膜分布的特點(diǎn)，證實(shí)為小膠質(zhì)細(xì)胞。

2.2 TLR4mRNA的PCR結(jié)果TLR4mRNA的表達(dá)(Fig 1，2)和TLR4蛋白的表達(dá)(Tab 1)在趨勢(shì)上基本一致，對(duì)照組和高劑組與模型組比差異有顯著性，低劑量組和中劑量組差異無顯著性。缺氧/復(fù)氧激活了TLR4受體，梔子苷高劑組通過對(duì)TLR4受體的抑制發(fā)揮抗炎作用。

2.3TLR4、p-ERK1/2、p-IκB、p38的Western blot結(jié)果p-ERK1/2、p-IκB和 p38蛋白的表達(dá)對(duì)照組在梔子苷中劑組和高劑組與模型組比較差異均有顯著性(P＜0.01)。說明梔子苷中劑組和高劑組是通過抑制ERK1/2、IκB和p38蛋白磷酸化激活而發(fā)揮作用的。

Fig 1 The expression of TLR4Mrna in microglia

Fig 2The expression of TLR4mRNA in microglia(±s，n=3)*P＜0.05 vs model

Fig 3 The expression of TLR4，p-ERK1/2，p-IκB、p38

2.4MyD88和NF-κB的免疫熒光雙染結(jié)果NF-κB p65的核移位是NF-κB活化的標(biāo)志，也是有關(guān)NF-κB生理病理變化的開始。從Fig 4中可以看出模型組和梔子苷低劑組的NF-κB p65在細(xì)胞核表達(dá)較高，對(duì)照組、梔子苷中劑組和高劑組與模型組比較主要表達(dá)在胞質(zhì)中，細(xì)胞核中較少。說明缺氧/復(fù)氧促使NF-κB p65磷酸化并進(jìn)入核中，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性。MyD88主要表達(dá)在胞質(zhì)中，模型組和梔子苷低劑組表達(dá)較高，對(duì)照組、梔子苷中劑組和高劑組與模型組比較較少，表達(dá)趨勢(shì)與NF-κB p65核轉(zhuǎn)位趨勢(shì)一致。

3 討論

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是天然免疫受體家族，目前發(fā)現(xiàn)的TLR家族蛋白有13種，其中Toll樣受體4(toll-likereceptor4，TLR4)是研究較為深入的受體，已證實(shí)TLRs在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，且其表達(dá)程度受到缺氧、炎癥因子等一系列內(nèi)源性或外源性因素刺激的調(diào)節(jié)［2］，提示TLRs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥免疫反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。TLR4受體在腦缺血/再灌注過程中被激活［3］，在缺血/缺氧狀態(tài)下，腦組織中的一些內(nèi)源性介質(zhì)可以作為配體激活TLR4受體，例如熱休克蛋白(heat-shock proteins，HSP)，其中HSP70可以通過CD-14依賴方式激活TLR4受體來傳導(dǎo)促炎癥反應(yīng)信號(hào)，經(jīng)MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的分泌［4］。MyD88的啟動(dòng)使其下游的I-κB迅速磷酸化激活，與NF-κB解離，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與p38、ERK1/2磷酸化后激活的激活蛋白1(AP-1)共同作用促使細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8等的分泌，形成組織周圍的炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)也證實(shí)缺氧/復(fù)氧激活了TLR4通路，模型組TLR4mRNA和蛋白較對(duì)照組均表達(dá)上調(diào)，通路下游 MyD88、p-IκB、p38 和 p-ERK1/2 磷酸化蛋白表達(dá)增多，NF-κBp65入核率增加，提示缺氧/復(fù)氧使小膠質(zhì)細(xì)胞活化，通過MyD88的依賴TLR4通路發(fā)揮免疫作用。

Fig 4 The immunofluorescence double staining of MyD88 and NF-κBp65(×100)

梔子是藥食兩用傳統(tǒng)中藥，藥用梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)，性寒味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒之功效。梔子苷是從梔子中提取的環(huán)烯醚萜苷類化合物。國(guó)內(nèi)外研究顯示，梔子苷具有抗炎［5］、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、降壓、保肝利膽、抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶、保護(hù)缺血性腦神經(jīng)損傷等作用［6］。在對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧時(shí)，我們加入了終濃度分別為125、250和 500 μmol·L－1梔子苷，發(fā)現(xiàn)對(duì)于 TLR4mRNA 和TLR4蛋白只有 500 μmol·L－1與模型組比較差異有顯著性，而對(duì)于 MyD88、p-IκB 、NF-κB、p-ERK1/2和 p38 蛋白，梔子苷250 和500 μmol·L－1均表現(xiàn)出了抑制作用。其機(jī)制可能是缺氧/復(fù)氧使小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一些內(nèi)源性配體活化，在激活TLR4通路的同時(shí)也激活了TLRs的其他通路，如TLR2或TLR6等，這些通路也可依賴MyD88途徑激活下游蛋白(我們后期的實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，缺氧/復(fù)氧后TLR2和TLR6的mRNA和蛋白的表達(dá)增加)。因此，梔子苷抑制了缺氧/復(fù)氧引起的TLR4mRNA和通路蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制了一系列瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮抗炎效應(yīng)。但通路之間的交叉串流使梔子苷治療腦缺血的機(jī)制更加復(fù)雜，有待于我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

［1］Takeuchi O，Akira S.Pattern recognition receptors and inflammation［J］.Cell，2010，140:805 －20.

［2］張 清，孫 鵬，馮新民.Toll樣受體4蛋白在大鼠腦缺血/再灌注損傷中的表達(dá)及其意義［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，37:219－21.

［2］Zhang Q，Sun P，F(xiàn)eng X M.Expression of TLR4 protein in rats with partial cerebral ischemia/reperfusion injury and its significance［J］.J Huazhong Univ Sci Technol(Med Edit)，2008，37:219－21.

［3］Zhang Q，Sun P，F(xiàn)eng X M，et al，Effects of propofol on the mRNA expression of toll-like receptor 4 in BV-2 cells during mimic ischemia-reperfusion injuryin vitro［J］.J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci，2008，37:219 －21.

［4］Asea A，Rehli M，Kabingu E，et al，Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70:role of toll like receptor(TLR)2 and TLR4［J］.J Biol Chem，2002，277:15028 －34.

［5］丁嵩濤，劉洪濤，李文明，等.梔子苷對(duì)氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(6):725 －9.

［5］Ding S T，Liu H T，Li W M，et al.Protective effects of geniposide on human umbilical vein endothelial cell injury induced by H2O2in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(6):725 － 9.

［6］武海霞，張丹參，沈麗霞，等，梔子苷對(duì)急性乙醇中毒致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用［J］.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，27(2):18 －20.

［6］Wu H X，Zhang D S，Shen L X，et al.The protective effects of geniposide on memory impaired mices induced by acute alcoholic intoxication［J］.J Hebei North Univ(Med Edit)，2010，27(2):18－20.