應(yīng) 劍，胡江原，陳 陽(yáng)，Samuel Schacher，杜冠華

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心，北京 100050;2.美國(guó)哥倫比亞大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)科學(xué)系，紐約 10032)

海洋軟體動(dòng)物海兔(aplysia californica)神經(jīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，神經(jīng)細(xì)胞胞體大且數(shù)量少、便于實(shí)驗(yàn)操作，是研究學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)功能的重要模式生物。20世紀(jì)60年代，Kandel等［1］對(duì)海兔縮鰓反射的神經(jīng)通路進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)來(lái)自噴水管的感覺信息經(jīng)胸膜神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元SN傳至腹部神經(jīng)節(jié)的L7運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，L7支配鰓肌，控制縮鰓運(yùn)動(dòng)。80年代，Glanzman等［2］建立了SN和L7的共培養(yǎng)模型(SN/L7)，即分別分離L7和單個(gè)SN后，轉(zhuǎn)移至玻璃底培養(yǎng)皿中共同培養(yǎng)，用玻璃微電極將SN和L7的軸突輕輕搭在一起，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，SN和L7之間可形成特異的突觸連接。

介導(dǎo)SN/L7突觸瞬時(shí)興奮傳遞的遞質(zhì)是谷氨酸［3］。谷氨酸作用于突觸后膜的興奮性氨基酸受體，使突觸后膜對(duì)Na+、K+的通透性增加，Na+內(nèi)流大于K+外流，突觸后膜局部去極化，從而產(chǎn)生興奮性突觸后電位(EPSP)。在適當(dāng)條件下，SN/L7可表現(xiàn)出短時(shí)程或者長(zhǎng)時(shí)程的突觸可塑性，模擬自然條件下海兔縮鰓反射的習(xí)慣化和敏感化。短時(shí)程突觸可塑性主要依賴于離子通道的修飾和遞質(zhì)釋放的變化，通過(guò)一系列下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可能對(duì)長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性產(chǎn)生影響。

匹諾塞林(PNCB)是蜂膠中含量最高的黃酮類化合物［4］，具有抗炎［5］、殺菌［6－7］、抗氧化［8］、舒張血管［9］、神經(jīng)保護(hù)［10－12］等廣泛的藥理作用。在藥物篩選以及對(duì)PNCB抗腦缺血損傷機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)PNCB作用于K+通道、Ca2+通道、NMDA受體、GABA受體等多種離子通道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察PNCB對(duì)海兔SN/L7的電生理活動(dòng)的作用，探討PNCB對(duì)海兔神經(jīng)細(xì)胞短時(shí)程突觸可塑性和長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性的影響，為PNCB對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用機(jī)制的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料不同年齡段的加州海兔，分別用于分離L7細(xì)胞(幼年海兔，體質(zhì)量2 g)、SN細(xì)胞(成年海兔，體質(zhì)量60～80 g)，抽取淋巴血液(成年海兔，體質(zhì)量約1 kg)，均購(gòu)于美國(guó)邁阿密大學(xué)海兔國(guó)家資源庫(kù)。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。PNCB(純度大于98%)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所吳松教授提供。

1.2SN/L7細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)SN/L7共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法［2］，從成年海兔的胸膜神經(jīng)節(jié)分離SN，從幼年海兔的腹部神經(jīng)節(jié)分離L7。將兩個(gè)神經(jīng)細(xì)胞移至同一個(gè)玻璃底培養(yǎng)皿中，用微電極輕輕撥動(dòng)軸突，使兩個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的軸突相互接觸，并于18℃靜置培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)基為含50%海兔淋巴血液和100 mmol·L－1L-谷氨酸的L15培養(yǎng)基。共培養(yǎng)體系隔天換液，d 5開始實(shí)驗(yàn)。

1.3電生理技術(shù)應(yīng)用全細(xì)胞電生理技術(shù)記錄SN/L7的興奮性突觸后電位(EPSP)［13］。將刺激電極靠近SN的細(xì)胞體，設(shè)定工作電位為－85 mV，對(duì)SN胞體施加電刺激，每個(gè)刺激持續(xù)0.3～0.5 ms;將記錄電極插入L7的細(xì)胞體引出EPSP。

1.4匹諾塞林對(duì)SN/L7的電生理活動(dòng)的影響將50%的L15培養(yǎng)基與50%的人工海水(ASW)混合均勻，即 L15/ASW 工作液。精密稱取 PNCB，用DMSO 梯度稀釋至 10、20、30、40、100、200、300、400 mmol·L－1，使用前再用 L15/ASW 稀釋1 000倍待用。細(xì)胞培養(yǎng)至d 5時(shí)，用L15/ASW輕輕洗去培養(yǎng)基，記錄SN/L7的初始EPSP;然后用10ml含不同濃度PNCB的L15/ASW溶液替換L15/ASW，室溫靜置5 min后，再記錄EPSP。對(duì)于PNCB給藥濃度為0.1～0.4 mmol·L－1的實(shí)驗(yàn)組，用L15/ASW充分洗去藥物，換成細(xì)胞培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并分別于 1、24 h 記錄 EPSP。另取 0.01 mmol·L－1PNCB孵育過(guò)的SN/L7，洗去或不洗去藥物，加入0.005 mmol·L－15-HT 溶液孵育5 min，記錄 EPSP。

另取一批細(xì)胞，于d 5用L15/ASW洗去細(xì)胞培養(yǎng)基后，記錄 SN/L7的初始 EPSP。再用含0.01 mmol·L－1PNCB 的 L15/ASW 孵育 SN/L7，每 20 min換液1次，共5次。然后用L15/ASW洗去藥物，換回細(xì)胞培養(yǎng)基于18℃繼續(xù)培養(yǎng)。d 6重復(fù)以上孵育步驟。d 7用L15/ASW洗去細(xì)胞培養(yǎng)基后，記錄EPSP。

2 結(jié)果

2.1匹諾塞林降低SN/L7的興奮性突觸后電位(EPSP)的作用SN和L7轉(zhuǎn)移至玻璃底培養(yǎng)皿后，開始貼壁生長(zhǎng)，搭在一起的軸突之間逐漸形成突觸。伴隨著突觸成熟，可以記錄到幅值越來(lái)越高的EPSP。d 4～5，細(xì)胞成熟(Fig 1)，EPSP的幅值也基本穩(wěn)定［14］。

Fig 1 Typical SN/L7 co-culture at day 1，3 and 5

使用培養(yǎng)至d 5的細(xì)胞，考察不同濃度的PNCB對(duì)SN/L7的EPSP的影響。以PNCB作用前細(xì)胞的初始EPSP幅值為基準(zhǔn)值，計(jì)算藥物作用后的EPSP幅值相對(duì)于初始值的百分比。對(duì)照組細(xì)胞用含0.1%的DMSO的L15/ASW孵育5 min后，用同樣的指標(biāo)計(jì)算EPSP幅值的變化。在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，對(duì)照組的EPSP幅值略有增高，但無(wú)顯著性變化;而PNCB(0.01 ～0.4 mmol·L－1)作用5 min，使 SN/L7的峰電位消失、突觸電位降低(Fig 2)。

Fig 2 Normalized EPSP amplitude(%pretreatment baseline)in Aplysia SN/L7 co-cultures after 5 min incubation of 0.01 ～ 0.4 mmol·L-1pinocembrin

當(dāng) PNCB濃度低于0.1 mmol·L－1時(shí)，其降低EPSP的作用強(qiáng)度與給藥劑量呈負(fù)相關(guān)的線性關(guān)系(r＞0.995)。而在 0.1 ～0.4 mmol·L－1的濃度范圍內(nèi)，PNCB降低EPSP的作用強(qiáng)度與給藥劑量呈正相關(guān)的線性關(guān)系(r＞0.998)。當(dāng)PNCB濃度為0.4 mmol·L－1時(shí)，EPSP的幅值僅為初始幅值的(30.7±5.1)%(P＜0.01)。此外，當(dāng)藥物濃度 ＞0.1 mmol·L－1時(shí)，細(xì)胞靜息電位也受到影響，觀察到一定程度的去極化。

2.2匹諾塞林可逆性降低EPSP幅值的作用PNCB與海兔神經(jīng)細(xì)胞作用后，洗去含 PNCB的L15/ASW，置換成細(xì)胞培養(yǎng)基，于18℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，EPSP的幅值即回升為初始幅值的71% ～89%;繼續(xù)培養(yǎng)24 h，則大多數(shù)細(xì)胞的EPSP幅值恢復(fù)至初始值。結(jié)果表明，PNCB對(duì)海兔神經(jīng)細(xì)胞EPSP幅值的抑制作用是可逆的，將PNCB洗去后EPSP可以得到恢復(fù)。而動(dòng)作電位幅度的恢復(fù)與PNCB的濃度無(wú)直接關(guān)系(Tab 1)。

2.3匹諾塞林抑制SN/L7對(duì)5-HT的反應(yīng)性的作用海兔神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)一個(gè)中間神經(jīng)元釋放5-HT至SN和L7的突觸連接，易化突觸傳遞。在體外培養(yǎng)體系中，用0.005 mmol·L－1的5-HT刺激細(xì)胞，可以使細(xì)胞的EPSP升高，甚至出現(xiàn)尖銳的峰電位(Fig 3A)。用 0.02 mmol·L－1PNCB 孵育細(xì)胞5min使SN/L7的EPSP幅值下降，再加入5-HT(終濃度為0.005 mmol·L－1)孵育5 min后，未見EPSP幅值升高或峰電位出現(xiàn)(Fig 3B)。撤除PNCB后靜置5 min再給予5-HT刺激，則可以記錄到EPSP幅值增加或者峰電位(Fig 3C)。

Tab 1 Normalized EPSP amplitude in Aplysia SN/L7 co-cultures after removal of pinocembrin(±s，n=3)

Tab 1 Normalized EPSP amplitude in Aplysia SN/L7 co-cultures after removal of pinocembrin(±s，n=3)

The initial EPSP level of each culture is marked as 100%

Pinocembrin concentration/mmol·L －1 Normalized EPSP amplitude/%0 1 h 24 h 0.1 81.4 ±8.6 77.7 ±23.6 96.7 ±4.7 0.2 62.8 ±12.8 71.5 ±18.2 87.3 ±5.1 0.3 45.4 ±2.6 71.6 ±3.8 106.3 ±0.1 0.4 30.7 ±5.1 88.8 ±9.8 105.8 ±3.0

Fig 3 Pinocembrin inhibited the spike evoked by 5-HT in Aplysia SN/L7 co-cultures.

2.4匹諾塞林對(duì)SN/L7長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性的作用

為考察PNCB是否影響SN/L7的長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性，在d 5和d 6分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.01 mmol·L－1PNCB，并在 d 6 給藥24 h 后記錄 EPSP。結(jié)果表明，對(duì)照組的EPSP幅值為給藥前的(104.1±10.5)%;PNCB給藥組的EPSP幅值為給藥前的(96.6±4.7)%。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組EPSP的變化差異沒(méi)有顯著性。

3 討論

負(fù)責(zé)海兔SN/L7突觸興奮性傳遞的主要遞質(zhì)是谷氨酸。海兔神經(jīng)細(xì)胞的突觸后膜上存在NMDA、AMPA型等谷氨酸受體［15］。本實(shí)驗(yàn)證明，給予5 min 0.01～0.4 mmol·L－1PNCB 的刺激，可抑制海兔SN/L7的電生理效應(yīng)，使EPSP幅值降低。這一現(xiàn)象表明，PNCB對(duì)SN/L7的興奮性突觸傳遞有一定程度的抑制作用，其抑制SN/L7突觸的興奮性的作用可能與NMDA型谷氨酸受體有關(guān)。

以0.1 mmol·L－1為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，抑制作用呈現(xiàn)兩相性，即PNCB 的濃度在0.01～0.1 mmol·L－1的范圍內(nèi)，抑制作用隨著藥物濃度增加而減弱;而當(dāng)PNCB的濃度在0.1～0.4 mmol·L－1的范圍內(nèi)時(shí)，抑制效應(yīng)隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)。且這兩相均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性。因此，PNCB抑制SN/L7興奮性突觸傳遞的作用在不同濃度下可能有不同的機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞NMDA受體可分為突觸型(NMDARs)與非突觸型(NMDARn)兩類。NMDA抑制劑，如美金剛等，在低濃度時(shí)優(yōu)先抑制NMDARn，對(duì)NMDARs的抑制較弱，使得NMDARs相對(duì)活化;隨著抑制劑的濃度增加，NMDARs才被明顯抑制［16］。這一現(xiàn)象有助于解釋本實(shí)驗(yàn)中觀察到的PNCB抑制海兔SN/L7 EPSP的兩相性。

神經(jīng)細(xì)胞SN/L7與PNCB作用后，撤除PNCB可以使神經(jīng)細(xì)胞的EPSP幅值恢復(fù)至初始值。這一結(jié)果提示，PNCB對(duì)其作用靶點(diǎn)的抑制作用是可逆的。

5-HT有易化SN/L7神經(jīng)突觸的作用。生理狀態(tài)下，用0.005 mmol·L－15-HT孵育SN/L7共培養(yǎng)體系5min，即可記錄到EPSP增強(qiáng)。PNCB的作用使SN/L7對(duì)5-HT的反應(yīng)性消失;而撤除PNCB后，這一反應(yīng)性迅速得以恢復(fù)，提示PNCB對(duì)5-HT易化神經(jīng)突觸的通路也有可逆的抑制作用。用5-HT刺激體外SN/L7共培養(yǎng)細(xì)胞，模擬的是海兔縮鰓反射的敏感化。5-HT作用于SN/L7的突觸前膜，激活腺苷酸環(huán)化酶，繼而使蛋白激酶磷酸化，磷酸化的蛋白激酶作用于突觸前膜的鉀離子通道使之關(guān)閉，鉀離子外流減少，使動(dòng)作電位到來(lái)之前的去極化時(shí)間延長(zhǎng)，從突觸前膜釋放的谷氨酸增加，EPSP的幅值隨之增加，突觸效能增強(qiáng)［17－18］。因此，PNCB 可逆地抑制SN/L7共培養(yǎng)體系對(duì)5-HT的反應(yīng)性，可能與PNCB對(duì)突觸后膜谷氨酸受體的可逆性抑制有關(guān);此外，由于PNCB具有開放鉀離子通道的作用［9］，PNCB也可能通過(guò)開放突觸前膜的鉀離子通道，減少谷氨酸釋放，實(shí)現(xiàn)其抑制作用。

模擬5-HT誘導(dǎo)長(zhǎng)時(shí)程易化的實(shí)驗(yàn)方法，連續(xù)兩天用0.01 mmol·L－1PNCB孵育SN/L7細(xì)胞，24 h后 SN/L7的 EPSP幅值沒(méi)有明顯變化。表明PNCB對(duì)NMDA受體的抑制作用未在基因和蛋白水平產(chǎn)生更深遠(yuǎn)的影響。

此外，實(shí)驗(yàn)中還觀察到高濃度PNCB影響L7靜息電位，表現(xiàn)為部分去極化，表明高濃度PNCB可能在突觸后膜影響鉀離子外流或鈉離子內(nèi)流。由于有研究證明PNCB可開放鉀離子通道，因此，PNCB可能通過(guò)部分開放L7細(xì)胞膜上的鈉離子通道，影響其靜息電位。

綜上所述，PNCB作用于其SN/L7模型，總體表現(xiàn)為對(duì)突觸興奮性傳導(dǎo)的可逆性抑制。但是，在實(shí)驗(yàn)劑量下，PNCB不影響SN/L7的長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性。PNCB是一種藥理作用廣泛的化合物。本實(shí)驗(yàn)室在研究PNCB作用機(jī)制的工作中，發(fā)現(xiàn)PNCB與一系列病理通路關(guān)聯(lián)。其中，PNCB抗腦缺血損傷的作用與NMDA受體相關(guān)。但是，PNCB藥理作用的靶點(diǎn)究竟何在，仍然未有定論。本研究提示，PNCB可能通過(guò)作用于突觸前膜和突觸后膜的多種離子通道，產(chǎn)生復(fù)雜的瞬時(shí)效應(yīng)以及下游效應(yīng)。下一步工作將深入探討PNCB對(duì)離子通道的作用，相信不日將尋得PNCB的作用靶點(diǎn)。

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