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吲哚-3-原醇對復(fù)合因素所致肝纖維化大鼠的治療作用及部分機制研究

2011-06-09 02:10高愛梅
中國藥理學(xué)通報 2011年6期
關(guān)鍵詞:膠原纖維化肝臟

高愛梅,平 潔,2,汪 暉,2

(武漢大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系、2.食品與藥品評價研究中心,湖北 武漢 430071)

肝纖維化是各種致病因素引起肝臟慢性炎癥、壞死、纖維組織持續(xù)增生的病理過程,其發(fā)病與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成和降解失衡,在肝臟內(nèi)過度沉積有關(guān)。肝纖維化是肝硬化的早期病理改變和必經(jīng)階段,其發(fā)生、發(fā)展是影響諸多肝病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。吲哚-3-原醇(indol-3-carbinol,I3C)是葡萄糖蔓芹苷的前體,大量存在于十字花科類食用蔬菜如西蘭花等。研究發(fā)現(xiàn),I3C有抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)癌細胞凋亡、清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化等作用[1-2],常用來治療胸部、消化道、肝臟和前列腺等處的腫瘤[3-4]。有研究報道[5-6],I3C對二甲基亞硝胺、四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷有保護作用。本室前期分別在肝切片和細胞水平,證實I3C對肝細胞有保護作用,且能抑制ECM的主要來源細胞—肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSC)的增殖[7-8]。然而,其對整體動物肝纖維化是否有保護作用,目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究在整體水平觀察I3C對復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化的治療作用,并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1試劑與藥品I3C,美國Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;α-平滑肌肌動蛋白多克隆抗體(αsmooth muscle actin,α-SMA)免疫組化 SP法試劑盒,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;堿性磷酸酶、Western blot顯色劑購自Hyclone公司?;|(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)多克隆抗體購自Santa Cruz公司。GAPDH單克隆抗體購自上??党缮锛夹g(shù)有限公司。

1.2實驗動物♂Wistar大鼠,體質(zhì)量200~220 g,由湖北省疾病預(yù)防中心提供,SPF級,許可證號:SCXK(鄂)2006-2008。

1.3實驗方法48只♂Wistar大鼠,隨機分成6組,每組8只:正常對照組、I3C對照組、模型對照組、I3C小劑量組、I3C中劑量組、I3C大劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,除正常對照組和I3C對照組外,所有動物給予高脂低蛋白飼料(89.5%玉米粉,0.5%膽固醇,10%豬油),并飲用5% ~10%乙醇溶液(前3天5%乙醇,以后10%乙醇)。1周后首次皮下注射 40%CCl4橄欖油 5 ml·kg-1,以后每周兩次(周一、周四)注射3 ml·kg-1,連續(xù)3周。造模結(jié)束后,I3C小、中、大劑量組及I3C對照組分別腹腔注射I3C 3、6、12 和12 mg·kg-1,正常及模型對照組皮下注射等容量橄欖油(1 ml·kg-1)。連續(xù)給藥10 d后,斷頭處死動物,取血 3 ~5 ml,3 500 r·min-1離心10 min,制備血清,-20℃凍存;于肝右葉取肝組織,一部分用4%多聚甲醛固定24 h,石蠟包埋,4~7 μm厚連續(xù)切片做病檢,余下的肝組織-80℃凍存。

1.4檢測指標

1.4.1大鼠一般情況及生化指標的檢測包括大鼠的精神狀態(tài)、活動、皮毛光澤、食量及糞便等以及肝臟的外觀、顏色和質(zhì)地。按試劑盒說明比色法,測定肝組織Hyp、SOD和MDA的水平。

1.4.2病理學(xué)檢測部分肝組織以4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋,切片,作HE染色及Masson三色染色,觀察肝臟病理學(xué)改變及膠原含量。免疫組化SP法檢測肝臟α-SMA的表達。切片常規(guī)脫蠟至水,0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)5 min,加入3%H2O2室溫下孵育15 min,正常兔血清37℃封閉15 min;加一抗α-SMA多克隆抗體(1∶200),37℃孵育2 h;滴加生物素化二抗,37℃孵育20 min;滴加三抗,37℃孵育20 min;DAB顯色,蘇木精復(fù)染核,逐級脫水,透明,封片。胞質(zhì)染成棕黃色為陽性細胞。在顯微鏡下每張玻片選取5個10×40倍視野,輸入HMIAS-2000高清晰彩色圖文分析儀(武漢千屏影像技術(shù)公司),檢測陽性細胞區(qū)域面積。

1.4.3Western blot分析肝勻漿中MMP-2的表達

肝臟用組織裂解液勻漿后,BCA法測蛋白,取適量的蛋白樣本進行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳,將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上,用封閉液封閉1 h;加入1∶100稀釋的MMP-2一抗,室溫孵育2 h;取出NC膜洗滌后,再與辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗孵育1 h;洗滌后加底物,顯色,終止吸干。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)均以±s表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進行分析。圖表制作以Prism 5.0軟件操作。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況整個實驗過程中,無大鼠死亡。正常對照組及I3C對照組大鼠毛順有光澤,活潑好動,食量及大便正常;模型對照組大鼠皮毛疏松無光澤,精神萎靡,懶動,飲食減少,大便干燥松散不成形;I3C治療組一般狀態(tài)較模型對照組有所減輕。

2.2肝臟組織病理學(xué)

2.2.1肝臟外觀正常對照組和I3C對照組大鼠肝臟被膜光滑,呈紅褐色,質(zhì)地中等;模型對照組大鼠肝臟偏黃白色,油膩,無光澤,質(zhì)地偏硬,部分表面輕度桔皮樣變。經(jīng)I3C治療后,大鼠肝臟桔皮樣變減輕,肝臟色澤、質(zhì)地有不同程度改善。

2.2.2肝切片HE染色正常對照組(Fig 1A)及I3C對照組(Fig 1D)大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝索整齊,肝竇正常,無炎性細胞浸潤及纖維組織增生;模型對照組(Fig 1B)大鼠肝索紊亂,炎細胞浸潤和組織壞死明顯,彌漫的脂肪變性,纖維組織大量增生,形成粗細不一的纖維間隔并向小葉內(nèi)延伸;各給藥組(Fig 1C)炎細胞浸潤,組織壞死減輕,部分肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù),肝索排列較規(guī)則,纖維間隔縮短變窄,纖維化分期下降。

2.3肝臟膠原改變

2.3.1肝切片Masson染色正常對照組(Fig 2A)和I3C對照組(Fig 2D)僅有少量膠原表達于中央靜脈壁及匯管區(qū);模型對照組(Fig 2B)可見膠原纖維大量沉積于匯管區(qū),并沿匯管區(qū)向外延伸,形成厚薄不一的纖維間隔,分割包繞肝小葉,局部有假小葉形成;與模型對照組相比,I3C給藥組(Fig 2C)肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,肝索排列較整齊,膠原沉積明顯減少,纖維間隔變薄。Masson圖像分析(Fig 3)也證實,I3C能明顯降低大鼠肝組織膠原纖維的含量(P<0.05)。

Fig 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on liver histopathology(HE staining)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 2 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on liver collagen secretion(Masson’s trichrome staining)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 3 Effects of 3,6 and 12 mg·kg-1indole-3-carbinol(I3C)on liver collagen percentage in multiple hepatotoxic factors-induced rat liver fibrosis by semiquantitative analysis using Medical Color Image Analysis System(±s,n=4)

2.3.2肝臟Hyp含量的變化與正常對照組相比,模型對照組Hyp含量明顯升高(P<0.01);I3C各治療組可改善肝纖維化程度,降低肝組織Hyp含量(Tab 1)。

Tab 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on hydroxyproline(Hyp)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(±s,n=8)

Tab 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on hydroxyproline(Hyp)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(±s,n=8)

**P <0.01 vs normal control.

Group Dose/mg·kg-1 Hyp/mg·g -1 Normal control - 125±16 Fibrotic control - 352±96**Fibrotic+I3C 3 303±95 Fibrotic+I3C 6 259±131 Fibrotic+I3C 12 316±75 I3C control 12 166±23

2.4肝切片α-SMA免疫組化正常對照組(Fig 4A)和I3C對照組(Fig 4D)僅見α-SMA在血管壁及肝血竇Disse間隙內(nèi)少量表達,模型對照組(Fig 4B)α-SMA表達明顯,主要分布于竇周、膠原沉積處、纖維間隔處,I3C治療組(Fig 4C)α-SMA在表達范圍、強度上都減輕,且表現(xiàn)為一定的量效關(guān)系(Fig 5)。

Fig 4 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on expressions of α-smooth muscle actin(α-SMA)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 5 Effects of 3,6 and 12 mg·kg-1indole-3-carbinol(I3C)on expressions of α-smooth muscle actin(a-SMA)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats by semiquantitative analysis using Medical Color Image Analysis System(±s,n=3)

2.5肝勻漿MMP-2的Western blot分析Western blot檢測發(fā)現(xiàn),72 ku處顯示清晰的條帶為MMP-2(Fig 6),與正常組比較,模型對照組MMP-2降低,與模型對照組比較,給藥組MMP-2升高,尤以I3C大劑量組明顯。

Fig 6 Western blot analysis of matrix metalloproteinases-2(MMP-2)of indole-3-carbinol(I3C)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats

2.6肝組織抗氧化指標與正常對照組比,模型對照組MDA含量明顯升高,SOD活性明顯降低(P<0.01);與模型對照組比,I3C治療組可升高SOD活性,尤以大劑量組明顯(P<0.01)。見Tab 2。

3 討論

慢性肝損傷模型主要有CCl4、白蛋白、乙醇和復(fù)合因素慢性肝損傷模型。復(fù)合因素中的3種因素(CCl4、乙醇、高脂低蛋白飼料)均能損傷肝細胞,長期給予CCl4、乙醇、高脂低蛋白飼料后,損傷的肝臟可進一步發(fā)生纖維化,較單因素模型具普遍性和現(xiàn)實意義,能更準確模擬自然生活環(huán)境,適用于抗肝纖維化的藥物作用研究。本實驗中,復(fù)合因素處理大鼠4周后即可見肝細胞脂肪變性明顯,肝臟門管區(qū)纖維組織增生,部分伸入肝小葉,同時肝指數(shù)和肝臟Hyp含量明顯升高,說明本實驗中肝纖維化模型的復(fù)制是成功的。

Tab 2 Effect of indole-3-carbinol(I3C)on liver homogenate SOD and MDA in rats(±s,n=8)

Tab 2 Effect of indole-3-carbinol(I3C)on liver homogenate SOD and MDA in rats(±s,n=8)

**P <0.01 vs normal control;#P <0.05,##P <0.01 vs fibrotic control.

Group Dose/mg·kg-1 MDA/μmol·g-1Pro SOD/kU·g-1Pro Normal control - 3.3 ±0.9 146±16 Fibrotic control - 5.4 ±1.7** 124±13**Fibrotic+I3C 3 4.8 ±2.0 133 ±11 Fibrotic+I3C 6 7.7 ±2.2 155 ±42#Fibrotic+I3C 12 11.2 ±5.4 193 ±17##I3C control 12 4.3 ±1.2 120 ±40

有報道,I3C對二甲亞硝胺、CCl4所致的急性肝損傷有保護作用[5-6],那么 I3C對慢性肝損傷是否同樣具有保護作用呢?本研究利用復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化模型,觀察了I3C對肝纖維化的治療作用。HE染色結(jié)果顯示,I3C能夠部分改善肝細胞的變性和壞死程度,促進肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

已知自由基的大量生成和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加重是CCl4致肝細胞毒性的主要細胞機制,而且在CCl4致大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與纖維生成呈明顯正相關(guān)[9]。此外,乙醇的代謝產(chǎn)物,如乙醛,能夠直接誘導(dǎo)HSC活化和膠原纖維的生成[10]。在本研究中,我們通過檢測肝組織中 MDA含量和SOD活性,證實了復(fù)合因素所致肝纖維化形成過程中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加重。肝纖維化大鼠經(jīng)I3C治療后,小劑量組MDA含量有所降低,SOD活性則明顯增加,且呈一定的量效關(guān)系,提示I3C對肝細胞具有一定的保護作用,使其抗氧化能力增強。

HSC的激活是肝纖維化形成的關(guān)鍵,本研究觀察了 HSC 活化的特異性標志物——α-SMA[11]。首先,利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了α-SMA在肝組織中的定位表達情況,研究結(jié)果顯示,I3C給藥組α-SMA的陽性表達比模型對照組明顯減少,半定量分析結(jié)果亦顯示出顯著性差異,且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性,說明I3C可減少活化HSC的數(shù)量,阻斷肝纖維化形成的始動階段。

此外,膠原作為一種ECM,是纖維化肝臟的主要成分之一[11]?;罨腍SC合成大量膠原,使肝臟的膠原合成與降解失衡,而Hyp被認為是膠原的主要成分,因此本研究通過測定肝組織Hyp的含量來間接反映HSC激活和肝內(nèi)膠原情況。結(jié)果顯示,模型對照組大鼠肝組織Hyp含量較正常對照組明顯增加,而各給藥組Hyp含量則有不同程度的下降,這與Masson三色染色所觀察到的肝臟膠原含量的半定量分析結(jié)果一致。肝纖維化是ECM合成大于降解,在肝臟內(nèi)過度沉積所致。ECM的合成和降解過程主要由基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)/MMPs這對平衡劑來調(diào)節(jié)。MMPs可降解ECM,亦可以被內(nèi)源性抑制因子 TIMPs 所抑制[12-13]。文獻報道[14],肝纖維化恢復(fù)期,由于HSC的凋亡,TIMPs表達減少,其對MMPs的抑制作用也減弱,MMPs活性增強,膠原降解增加,肝纖維化逆轉(zhuǎn)。本研究檢測肝勻漿MMP-2蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)I3C能促進MMP-2表達。以上結(jié)果說明I3C能夠增強MMPs活性,促進ECM降解,降低肝臟膠原沉積,促進肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

目前I3C在臨床上主要用于腫瘤的輔助治療。臨床和動物實驗均已證實,I3C毒副作用小,安全范圍較寬。本研究發(fā)現(xiàn),I3C對照組與正常對照組在病理檢查和生化指標上幾無差別,說明I3C在本研究受試濃度下較為安全。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)I3C能有效的治療復(fù)合因素所致的大鼠肝纖維化,其機制與其增強MMPs活性,促進ECM降解,并抗氧化有關(guān)。

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