鄭付春，黃展勤，石剛剛

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院藥劑科、2.醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東汕頭 515041)

Ca2+是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中最常見的“第二信使”，調(diào)節(jié)各種生理病理過程。有研究者認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可引起Egr-1過量表達(dá)［1］，Ca2+可通過不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)Egr-1的表達(dá)［2－3］。我課題組合成的專利化合物碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)具有良好的拮抗心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的作用［4－5］，此作用與其阻斷心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞膜鈣通道，防止鈣超載有關(guān)［6－7］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)F2可明顯抑制I/R心肌組織Egr-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平的升高，并同時(shí)減輕心肌組織炎性反應(yīng)及改善心肌功能［8］，表明對(duì)I/R狀態(tài)下心肌組織內(nèi)Egr-1過量表達(dá)的抑制可能是F2抗I/R損傷的分子機(jī)制之一［9］。結(jié)合上述概念及報(bào)道，具有鈣拮抗作用的藥物是否與F2一樣都可通過抑制Egr-1表達(dá)，從而對(duì)I/R損傷心肌組織起到保護(hù)作用呢，本實(shí)驗(yàn)采用3種不同結(jié)構(gòu)類型的常用鈣離子拮抗劑:維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平，探討它們對(duì)缺氧/復(fù)氧(H/R)心肌細(xì)胞損傷及Egr-1基因和蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示鈣離子拮抗劑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，美國(guó));酶標(biāo)儀(Thermo Labsystems公司，芬蘭);聚丙烯酰胺凝膠電泳相關(guān)材料(Bio-RAD公司，美國(guó));全自動(dòng)PCR擴(kuò)增儀(MJ，美國(guó));凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-RAD公司，美國(guó));維拉帕米(恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó));硝苯地平、地爾硫卓(Sigma，美國(guó));TRIzol試劑、PCR 試劑盒(Invitrogen，美國(guó));肌鈣蛋白測(cè)試試劑盒(BAYER公司，德國(guó));ELISAS試劑盒(Bender Medsystems公司，瑞士);Egr-1一抗(Santa Crutz公司，美國(guó));辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(中杉金橋生物工程公司，中國(guó))。

1.2原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)1～3 d SD大鼠(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，♀♂不拘，固定于無菌操作臺(tái)上。開胸取心室組織，剪碎至沙粒大小，加入10倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%胰蛋白酶，37℃消化10 min，組織塊沉降后棄上層液體。組織塊中繼續(xù)加入0.1% 的胰蛋白酶，37℃消化10 min，收集上層液體并及時(shí)用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)15%小牛血清的培養(yǎng)基滅活殘留胰酶活性;上述消化、收集過程反復(fù)4～5次。細(xì)胞混懸液，接種至容積為50 ml的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)30 min以使成纖維細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶和96孔板內(nèi)，同時(shí)加入5-BrdU使其終濃度為 0.1 mmol·L－1［6－7］，置 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日換液，d 4后培養(yǎng)基改用不含5-BrdU的培養(yǎng)基。

1.3H/R模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組:細(xì)胞先換用被高純氮?dú)怙柡?0 min的缺氧液(137 mmol·L－1NaCl，12 mmol·L－1KCl，0.49 mmol·L－1MgCl2，0.9 mmol·L－1CaCl2·H2O，4 mmol·L－1HEPES，20 mmol·L－1Na lactate)［10］，根據(jù)培養(yǎng)容器的大小充入純氮?dú)?，置于缺氧箱?7℃密閉培養(yǎng)3 h，繼續(xù)在正常培養(yǎng)基中按常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)1 h，造成復(fù)氧損傷。取培養(yǎng) d 5～6的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照(Control)組、H/R組、DMSO組、維拉帕米(Ver)組、地爾硫卓(Dil)組、硝苯地平(Nif，用DMSO溶解)組。H/R做缺氧/復(fù)氧模型;Ver組、Dil組、Nif組及DMSO組于缺氧液及復(fù)氧液中分別給予Ver(2 μmol·L－1)、Dil(10μmol·L－1)、Nif(10 μmol·L－1)及等容積的DMSO。Control組則于實(shí)驗(yàn)前4 h換用體積分?jǐn)?shù)15% 新生牛血清的培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4RT-PCR總RNA的提取用TRIzol試劑法提取總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA的濃度、純度測(cè)定，通過1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA樣品完整性的檢測(cè)。RT-PCR反應(yīng)取0.2 ml EP管加入總 RNA 2 μg、隨機(jī)引物 1 μl，用無核酸酶水補(bǔ)足至12 μl，70℃孵育5 min后分別加入反應(yīng)緩沖液4 μl、Ribonuclease inhibitor 1 μl、dNTP 2 μl，25℃ 孵育5 min后加入Revert Aid TM H Minus M-Mulv RT 1 μl，混勻后稍離心，25℃，10 min;42℃，60 min;70℃，10 min，合成cDNA。取0.2 ml EP管加入cDNA 1 μl、2 × Master Mix12.5 μl、應(yīng)用 β-actin 作為內(nèi)參照，方法同上僅應(yīng)用引物為β-actin正義及反義序列，PCR 條件:94℃，3 min;94℃，30 s;55℃，30 s;72℃，1 min;72℃，5 min。擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照和圖像分析。

1.5Egr-1蛋白測(cè)定培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞PBS洗滌2次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25% 胰蛋白酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%乙二胺四乙酸(V/V，1∶1)消化收集，再次加入PBS漂洗2 次，1 000 r·min－1，離心 10 min(4℃)，棄上清液，沉淀中加入適量的單去污裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r·min－1，離心 10 min(4℃)，取上清液，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，100℃變性4 min后備用。配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 的分離膠與質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 的濃縮膠，完全凝固后，每泳道加60 μg蛋白樣品，經(jīng)電泳(125 V，80 min)和轉(zhuǎn)膜(350 mA，60 min)后，在封閉液中封閉1 h，然后加入1∶200的Egr-1抗體稀釋液，4℃過夜，緩沖液洗膜3次，每次10 min，再加1∶1 500的二抗稀釋液室溫孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，加化學(xué)發(fā)光試劑于膜上，反應(yīng)1 min，壓片，曝光后將膠片進(jìn)行顯影、定影。

1.6心肌細(xì)胞損傷及自由基指標(biāo)測(cè)定比色法測(cè)定心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性;硫代巴比妥酸法測(cè)定心肌細(xì)胞丙二醛(MDA)的含量;黃嘌呤氧化酶法測(cè)定心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間的比較。

2 結(jié)果

2.1維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對(duì)Egr-1 mRNA表達(dá)水平的影響以Egr-1和β-actin光密度值的百分比來反映各組Egr-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。與Control組相比，H/R組及DMSO組培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞Egr-1 mRNA的表達(dá)水平明顯增高(P＜0.01)，Ver組、Dil組及Nif組Egr-1 mRNA的表達(dá)較H/R組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Fig 1 Effects of verapamil，diltiazem and nifedipine on expression of Egr-1 mRNA in rat cardiomyocytes

2.2維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對(duì)Egr-1蛋白表達(dá)水平的影響以H/R組的灰度值為100%則Control組、DMSO 組、Ver組、Dil組及 Nif組的灰度值分別為(13.56±2.99)%、(99.93±18.14)%、(32.94±7.68)%、(36.89±6.05)% 和(68.84±14.16)%。其中，與Control組比，H/R組和 DMSO組Egr-1蛋白表達(dá)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與H/R 組比，Ver組、Dil組及Nif組Egr-1蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。

Fig 2 Effects of verapamil，diltiazem and nifedipine on expression of Egr-1 protein in rat cardiomyocytes

2.3維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞上清液中CK、LDH活性的影響與Control組比，H/R組及DMSO組培養(yǎng)上清液中CK、LDH活力明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)。與H/R組比，Ver組、Dil組及Nif組CK、LDH活性均減弱(P＜0.01)。

Tab 1 Comparison of CK and LDH level of cultured medium(±s，n=15)

Tab 1 Comparison of CK and LDH level of cultured medium(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group

Group CK/kU·L－1 LDH/kU·L －1 Control 12.64 ±2.89 3019.84 ±297.4 H/R 57.18 ±9.32＊＊ 6940.04 ±407.7＊＊DMSO 55.04 ±5.16＊＊ 7003.74 ±570.3＊＊Ver 23.12 ±5.07## 3855.27 ±233.3##Dil 26.48 ±6.15## 4185.66 ±316.7##Nif 32.36 ±7.40## 4564.02 ±402.4##

2.4維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對(duì)心肌細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的影響與Control組比，H/R組及DMSO組心肌細(xì)胞中SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)。與H/R組比，Ver組、Dil組及Nif組MDA含量降低(P＜0.01)，SOD 活力增高(P＜0.05)。

Tab 2 Comparison of SOD and MDA level of cultured cardiomyocytes(±s， n=12)

Tab 2 Comparison of SOD and MDA level of cultured cardiomyocytes(±s， n=12)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group

Group SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Control 29.15 ±7.63 0.20 ±0.05 H/R 15.08 ±2.08＊＊ 0.99 ±0.29＊＊DMSO 16.14 ±2.29＊＊ 1.02 ±0.28＊＊Ver 26.99 ±8.03## 0.41 ±0.11##Dil 25.26 ±7.19## 0.44 ±0.14##Nif 20.80 ±6.37# 0.61 ±0.18##

3 討論

大量文獻(xiàn)報(bào)道，Egr-1的高表達(dá)與I/R損傷密切相關(guān)。采用基因敲除或反義寡核甘酸技術(shù)，為Egr-1的誘導(dǎo)和I/R損傷之間的因果關(guān)系提供了直接的證據(jù)［10－11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，I/R可誘導(dǎo)的 Egr-1表達(dá)上調(diào)，異常表達(dá)的Egr-1又可進(jìn)一步誘導(dǎo)一系列下游基因的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素(IL)1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP2)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)、組織因子(TF)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等，這些因子隨后啟動(dòng)的炎性反應(yīng)、凝血和血管高通透性正是I/R組織損傷的三大典型病理變化［10－11］。我們以往的研究與Yan等［10］研究結(jié)果基本一致，表明Egr-1的表達(dá)上調(diào)可能是I/R組織的一種共性表現(xiàn)。

心肌H/R損傷的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)鈣超載有密切關(guān)系。鈣超載是指Ca2+在細(xì)胞內(nèi)大量積聚，引起組織器官嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)及功能障礙，是心肌H/R損傷的特征之一。有不少文獻(xiàn)報(bào)道［12］，心肌I/R損傷時(shí)應(yīng)用鈣離子拮抗劑能拮抗這些損傷，從而對(duì)心肌起到良好的保護(hù)作用，改善心功能。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平3種經(jīng)典的鈣通道拮抗劑都能抑制心肌酶LDH和CK的釋放，降低H/R心肌細(xì)胞內(nèi)的MDA含量，提高SOD活性，防止細(xì)胞內(nèi)氧自由基的過量產(chǎn)生，減輕心肌細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，從而起到對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，H/R所致的心肌細(xì)胞Egr-1 mRNA和蛋白的過量表達(dá)可被維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平所抑制，Ca2+可通過不同的機(jī)制直接或間接影響Egr-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這可能是鈣離子拮抗劑保護(hù)心肌細(xì)胞(H/R)損傷的共同機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)采用H/R心肌細(xì)胞作為模型觀察維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對(duì)Egr-1的調(diào)節(jié)及心功能的作用。較比心肌組織的觀察，條件更易控制，結(jié)果更加精確可靠，充分驗(yàn)證了心肌組織的結(jié)果。從結(jié)果看，它們的作用大小并不完全相同，維拉帕米對(duì)Egr-1 mRNA和蛋白的抑制率分別為71%、67%，地爾硫卓為66%、63%，兩種作用基本相同，硝苯地平為35%、32%，作用相對(duì)較弱;心肌細(xì)胞損傷指標(biāo)測(cè)定結(jié)果也出現(xiàn)相同趨勢(shì)。這可能與3種拮抗劑各自的作用機(jī)制有關(guān)，盡管3種藥物都是L型鈣通道拮抗劑，都能通過抑制Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)拮抗心肌細(xì)胞H/R損傷，其中維拉帕米、地爾硫卓主要作用于心肌細(xì)胞的L型鈣通道，而硝苯地平主要作用于血管平滑肌細(xì)胞的L型鈣通道，對(duì)心臟的直接作用較小。鈣作為Egr-1表達(dá)的上游調(diào)控因子，由于上述鈣拮抗劑對(duì)不同組織的鈣通道的阻斷強(qiáng)度不一，也就造成了Egr-1表達(dá)的差異，這可能是導(dǎo)致拮抗心肌細(xì)胞損傷不同的原因之一。另外，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，維拉帕米、硝苯地平和地爾硫卓的濃度分別2、10及10 μmol·L－1時(shí)作用較強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)中各拮抗劑采用以上濃度。

我課題組前期F2的研究和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示我們?cè)谘芯库}拮抗劑作用于“第二信使”鈣離子時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步研究它對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子(第三信使)及下游因子的作用，這對(duì)于詳盡探討鈣拮抗劑作用機(jī)制將是非常有意義的。

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